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ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實驗，是目前廣泛應用于各種抗原抗體檢測的方法，主要有靈敏度高和特異性強的特點。ELISA操作步驟看似簡單，整個測定過程中卻有諸多影響因素，導致檢測結(jié)果可能與實際結(jié)果偏差較大。為幫助大家分析實驗中常見問題，我們將常見問題的可能原因和解決方法歸納總結(jié)于下表： 問題一：高背景或陰性對照值偏高 可能原因 | 建議 | 陰性對照孔被陽性對照或樣品污染 | 洗滌時，勿將洗液溢出孔外 | 抗體非特異性結(jié)合 | 封閉液不適合，更換封閉液 | 酶結(jié)合物過濃 | 請檢查酶結(jié)合物是否按說明書規(guī)定稀釋 | 孵育溫度過高 | 檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定 | 底物在使用前曝光 | 應保存在暗處，避光 | 讀板前停留時間過長 | 加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù) |
問題二：陽性對照值偏低或低吸光度
可能原因 | 建議 | 試劑未平衡至室溫 | 實驗開始前，將試劑盒從冰箱取出平衡至室溫 | 檢測體積偏小 | 檢查移液器吸液管道是否堵塞 | 孵育時間過短 | 使用計時器，準確孵育時間 | 底物受污染 | 使用新配置的試劑，重新實驗 | 包裝袋中有濕氣 | 檢查袋中是否有干燥劑 | 樣本中有抑制劑 | 疊氮鈉會抑制HRP酶的活性 |
問題三：邊緣效應
可能原因 | 建議 | 蒸發(fā) | 各步之間，須使用封版膠密封反應板 | 溫度不均勻 | 校準孵育箱，勿疊放反應板 |
問題四：標準曲線不佳
可能原因 | 建議 | 倍比稀釋標準品時未混勻 | 稀釋標準品的每一步均需混勻 | 過早稀釋 | 標準品在快要使用時稀釋 | 加入的體積不正確 | 使用校準過的移液器，快速、等量的將標準品分配到各個微孔中 |
問題五：標準曲標準曲線良好，但樣本無檢測信號
可能原因 | 建議 | 樣本中無檢測物或檢測物含量極低 | 設置內(nèi)參，重新實驗 | 樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測 | 作適當稀釋，降低其他物質(zhì)的干擾，或作系列稀釋，檢測回收率 | 樣本中檢測物濃度過高，Hook效應導致假低值 | 適當倍數(shù)稀釋樣本，檢測物濃度盡量在試劑盒檢測范圍內(nèi) |
問題六：重復性較差
可能原因 | 建議 | 微孔中有氣泡 | 用針尖挑破氣泡 | 試劑未混勻 | 確保充分混勻試劑 | 樣本中有雜質(zhì)或沉淀物 | 使用前離心 | 微孔包被面被吸頭劃破 | 加液時小心操作 | 使用用過的封板膠紙 | 每次須使用新的封板膠封住反應孔 |
問題七：假陽性反應 可能原因 | 建議 | 洗滌不充分 | 使用前需檢查洗板機是否正常工作 | 洗板機管道堵塞 | 需經(jīng)常維護洗板機 | 加結(jié)合物時，灑在微孔邊緣 | 小心向微孔加入結(jié)合物，加入微孔底部中央，避免與孔壁和邊緣接觸 | 檢測樣本中含有紅細胞 | 離心 | 微孔中液體揮發(fā) | 用封板膠密封反應孔，置于濕盒內(nèi) |
問題八：整塊板產(chǎn)生陽性OD值或整個板顯藍色
可能原因 | 建議 | 洗滌液體積不足或底物被殘留于孔底的結(jié)合物所污染 | 洗滌時，緩沖液充滿至孔邊緣，但要確保不能溢出孔外 | 結(jié)合物濃度過高 | 檢查是否按照說明書推薦比例稀釋 | 血清中有血清因子 | 勿加熱血清 | 底物容器不潔凈 | 用酸清洗容器瓶，用蒸餾水沖洗 | 底物孵育時，微孔板曝光 | 加底物時，立即將板置于暗處 |
問題九：整塊板OD值偏低
可能原因 | 建議 | 顯色時間不足 | 適當延長顯色時間 | 孵育溫度偏低 | 36度為最適反應溫度（欣博盛ELISA試劑盒） | 未加終止液 | 加入終止液，增強顏色反應的強度，穩(wěn)定最終的顏色反應 |
問題十：顯色緩慢
可能原因 | 建議 | 樣本未置于室溫 | 實驗開始前，將樣本平衡至室溫 | 酶結(jié)合物活性減弱 | 檢測稀釋度 | 酶活性收到抑制如疊氮鈉 | 避免實驗不當?shù)姆栏瘎?/span> | 顯色溫度不適當 | 按說明書操作 |
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