一、以臨床需求為導向

IgG4相關(guān)硬化性膽管炎（IgG4-Related Sclerosing Cholangitis，IgG4-SC）是新晉確立統(tǒng)一診斷名稱并受到研究關(guān)注的一類自身免疫性肝病，作為IgG4相關(guān)疾?。↖gG4-Related Disease, IgG4-RD）累及肝內(nèi)外大膽管時的疾病命名，具有IgG4-RD這一大類疾病的共同特點，包括血清IgG4升高（>135 mg/dL），組織學見席紋狀纖維化、大量淋巴漿細胞浸潤、IgG4陽性漿細胞比例高、閉塞性靜脈炎、輕至中度嗜酸性粒細胞浸潤。

IgG4-SC患者雖多數(shù)對激素治療應(yīng)答，但極易復(fù)發(fā)，一旦病情未經(jīng)控制，進展至肝硬化、肝衰竭等終末期肝病階段時，目前的糖皮質(zhì)激素等傳統(tǒng)藥物治療效果較差。因此，闡明IgG4-SC發(fā)病機制，并在此基礎(chǔ)上尋找敏感性和特異性兼具的早期診斷新標志物和特異性治療靶點，是我們所面臨的刻不容緩的科學問題之一。

二、另辟蹊徑，探索IgG4-SC免疫調(diào)控機制

目前研究對IgG4-RD的認識有限，在某些抗原刺激下誘發(fā)B細胞激活及大量IgG4分泌，以及T淋巴細胞持續(xù)激活產(chǎn)生促炎、促纖維化因子，最終導致纖維化進展。有學者提出假說，認為IgG4-SC患者的機體可能存在選擇性調(diào)節(jié)障礙，從而導致免疫應(yīng)答向Th2方向傾斜。

1、MDSC

髓系源性抑制細胞（Myeloid Derived Suppressor Cells，MDSC）是一群骨髓來源的祖細胞和未成熟細胞的異質(zhì)性細胞群，具有強大的抑制免疫應(yīng)答效應(yīng)，在多種免疫介導的疾病，包括腫瘤、慢性乙型肝炎、自身免疫性疾病等中都發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在病理情況下，MDSC可接受炎癥因子、髓系生長因子等信號信息，從而誘導擴增活化。目前為止，有關(guān)IgG4-SC的發(fā)病機制研究多數(shù)集中于T、B細胞等淋巴細胞領(lǐng)域，而髓系細胞參與的調(diào)控鮮有報道，特別是MDSC在IgG4-SC發(fā)生過程中的作用及機制尚未闡明。

2、RANKL-RANK信號通路

在研究IgG4-SC的發(fā)病過程中，有一種炎癥因子引起學者的關(guān)注。NF-κB受體激活蛋白配體（Receptor Activator for NF-κB Ligand，RANKL），又名為TNFSF11，屬于TNF超家族成員，其受體即NF-κB受體激活蛋白（Receptor Activator for NF-κB，RANK），最早發(fā)現(xiàn)RANKL-RANK通路參與破骨細胞分化成熟和淋巴結(jié)發(fā)育調(diào)控，隨后研究證實，其對B細胞、髓系細胞的分化發(fā)育具有重要作用。目前研究認為，RANKL-RANK通路在自身免疫性關(guān)節(jié)炎、慢性肝病中可能發(fā)揮促炎作用。

三、研究思路與成果

本研究共納入31例未治療的活動性IgG4-SC患者，并選取17例原發(fā)性硬化性膽管炎（Primary Sclerosing Cholangitis，PSC）患者、30例自身免疫性肝炎（Autoimmune Hepatitis，AIH）患者，以及40名健康志愿者（Healthy Control，HC）作為對照組。

1、MDSC和RNAKL在IgG4-SC高表達

為探究IgG4-SC患者的MDSC表達情況，我們利用流式細胞術(shù)來檢測MDSC的細胞表型標志物，并以HLA-DR-/loCD33+CD11b+來定義該細胞。我們發(fā)現(xiàn)相較于疾病對照組，包括PSC患者和AIH患者，以及健康對照組（HC），IgG4-SC患者外周血MDSC的比例和數(shù)量均顯著增加，而且以CD14+CD15- 的單核細胞型MDSC升高為主。

為進一步明確RANKL-RANK信號通路在IgG4-SC發(fā)病機制中的作用，我們應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）和免疫組化染色進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他分組相比，IgG4-SC患者肝內(nèi)和血清中的RANKL的表達水平大幅增加。

正常肝組織中見不到RANKL陽性細胞，但在IgG4-SC患者肝內(nèi)，受損的小葉間膽管周圍可見RANKL陽性細胞顯著聚集。分泌RANKL的細胞與成熟漿細胞的細胞標志物CD19、CD38和CD138，特別是CD38的定位一致。而MDSCs（特別是單核細胞性MDSC）在肝臟內(nèi)表達RANK。

進一步的，在我們將外周血RANKL水平與IgG4-SC患者臨床生化指標作關(guān)聯(lián)分析時，RANKL與IgG、IgG4，尤其是IgG4/IgG呈正相關(guān)關(guān)系，進一步支持產(chǎn)生免疫球蛋白的成熟漿細胞分泌RANKL在IgG4-SC發(fā)病機制中的作用。

2、MDSC為什么升高？——RNAKL誘導MDSC的擴增

在我們將31例IgG4-SC患者外周血RANKL的表達水平、MDSC比例與臨床生化指標進一步做相關(guān)性分析時，通過spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，外周血的RANKL水平與患者γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）水平成負相關(guān)（R2=0.1633，P=0.0365），但與外周血MDSC的比例成顯著正相關(guān)（R2=0.4865，P<>上述結(jié)果提示IgG4-SC患者的MDSC聚集與RANKL高水平表達有關(guān)。

為驗證RANKL對MDSC的直接誘導擴增作用，我們構(gòu)建了體外誘導MDSC的培養(yǎng)體系，并對RANKL誘導的最佳培養(yǎng)時間和劑量進行摸索。結(jié)果顯示，當RANKL的濃度為25 ng/mL，誘導培養(yǎng)5天時，可觀察到顯著的MDSC擴增，且擴增效果不劣于陽性對照組。

進行PAN T細胞增殖功能抑制實驗證實，RANKL誘導擴增的MDSC（無論聯(lián)合或不聯(lián)合GM-CSF），都能顯著抑制PAN T細胞的增殖，且當MDSC：PAN T細胞的細胞比例為1：4時，其免疫抑制效應(yīng)最佳，通過流式細胞術(shù)檢測一氧化氮（NO）的代謝產(chǎn)物DAF-FM-DA發(fā)現(xiàn)，RANKL誘導擴增的MDSC表達更高水平的NO。上述實驗證實，RANKL誘導擴增的MDSC具有其特異性的免疫抑制功能。

此外，我們發(fā)現(xiàn)RANKL可通過促使MDSC表面的趨化受體CCR5、CXCR3以及CX3CR1表達豐度升高，誘導MDSC向肝臟募集。由于RANKL與其受體RANK結(jié)合后可激活NF-κB信號通路，我們利用NF-κB的通路抑制劑BAY 11-7082和CAPE，阻斷細胞內(nèi)NF-kB信號通路的激活，可以發(fā)現(xiàn)，在加入抑制劑后，MDSC的擴增效應(yīng)不再。

3、MDSC升高后效應(yīng)？——MDSC調(diào)控CD4+T細胞的分化

在明確RANKL誘導擴增有免疫抑制效應(yīng)的MDSC的機制之后，我們專注于MDSC的抑制功能對IgG4-SC疾病發(fā)生發(fā)展的影響。我們利用健康志愿者的外周血單個核細胞（PBMC），建立體外誘導Th1和Th2型細胞分化的培養(yǎng)體系。

有趣的是，在誘導Th2型分化的培養(yǎng)體系中，加入GM-CSF聯(lián)合IL-6誘導的MDSC仍抑制T細胞的分化，而加入RANKL誘導的MDSC后T細胞向Th2分化程度更高，在RANKL誘導的MDSC與Th2型細胞分化共培養(yǎng)體系中，加入iNOS抑制劑1400W，則能顯著抑制RANKL誘導擴增的MDSC發(fā)揮促Th2型分化作用。

因此，我們推測IgG4-SC患者體內(nèi)升高的MDSC可能通過分泌NO，促進T細胞向Th2型分化，從而加重疾病進展。

四、小結(jié)與展望：

總結(jié)上述工作，我們創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)，IgG4-SC患者體內(nèi)漿細胞來源的RANKL能誘導MDSCs的擴增和活化，后者可調(diào)控CD4+ T細胞的分化方向，揭示導致IgG4-SC慢性化和纖維化發(fā)生的疾病新機制。

MDSCs作為骨髓來源的免疫調(diào)節(jié)細胞，積極參與IgG4-SC免疫微環(huán)境中的“肝-骨對話”，RANKL誘導的MDSC信號途徑可能作為未來治療IgG4-SC的免疫治療靶點。