經(jīng)過指導(dǎo)原則發(fā)布后的倉促初讀，已經(jīng)梗概了此次正式版的重要變化內(nèi)容。相信大家還是想更加詳細的了解正式版和Draft版的變化細節(jié)。現(xiàn)對兩個版本的變化進行系列解讀，希望能給業(yè)內(nèi)同仁提供有用的信息。

一、標(biāo)題部分：

從“Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products” 變成了“Immunogenicity Testing of TherapeuticProtein Products —Developing and Validating Assays for Anti-Drug AntibodyDetection”

解讀：語句描述進行了調(diào)整，重點從Draft版的方法調(diào)整到了新版的免疫原性檢測上。新的標(biāo)題覆蓋面更廣，而且跟FDA現(xiàn)有的另2篇關(guān)于免疫原性的指導(dǎo)原則從標(biāo)題上的一致性更好了。從這個標(biāo)題大有可以寫一個系列的可能性了。

二、發(fā)行部門部分：

去掉了“Center for Devices and Radiological Health (CDRH) ”

解讀：原因不明，不敢妄加揣測。

三、Introduction部分

P5第一段第一句中，描述從“validation of immune assays”改為“validation of assays”

解讀：新描述更加準確，更好的涵蓋了cell-based assay。正式版在行文方面更加的嚴謹。*類似的單詞調(diào)整全文很多，不一一列舉，僅解讀重點部分。

P6第一行，描述中添加“some peptides, olignucleotides”

解讀：新描述更加體現(xiàn)了case by case的原則，對于分子量小，結(jié)構(gòu)相對簡單的小肽，核酸，免疫原性也是需要根據(jù)不同場景進行考量，不能一刀切。根據(jù)產(chǎn)品的風(fēng)險評級進行是否進行免疫原性或者如何進行免疫原性評級的策略制定。如何評估風(fēng)險在USP的1106章節(jié)有詳細描述。大家感興趣的可以自行參閱。這塊的加入也增大了實際的執(zhí)行難度，畢竟對于風(fēng)險評估的把控還是很復(fù)雜的。

P6第二段描述中添加“This document does not discuss the product and patient risk factors that may contribute to  immunogenicity”改為“This document does not discuss the rationalefor ADA testing or the subject- and product-specific risk factors that may contribute to  immunogenicity”

解讀：屬于描述性修改，比較有意思的地方是新版全篇正文中再無“patient”這個詞了。個人感覺因為臨床試驗中并不是所有受試者都是患者，draft版的patient描述確實不妥。

三、Background部分

新版中描述“Immune responses to therapeutic proteinproducts have the potential to affect product pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety, and efficacy”

解讀：明確了免疫原性的作用：解釋PK，PD安全性和有效性。個人認為加的很好，強調(diào)了免疫原性不是一個獨立的指標(biāo)。后文多處都進行了對應(yīng)的修改，添加了PK，PD的描述。

新版中描述“The clinical effects of immuneresponses in subjects are highly variable, ranging from no measurable effect to extremely harmful”

    解讀：進一步去patient化，并且把draft中的no effect改為更準確的“no measurable effect”。一個限定詞的增加使得描述更科學(xué)。目前我們能夠報告的無響應(yīng)更多是基于我們所采用的分析方法。一個方法中的無響應(yīng)，在采用更加靈敏和特異的方法后可能將會出現(xiàn)響應(yīng)。

四、General principles部分

新增2個小標(biāo)題“A. Assays for ADA Detection ”和“ B. Limitations in Comparing ADA Incidence Across Products ”

解讀：正文部分描述有較多調(diào)整，但是大意沒變，兩個小標(biāo)題的加入使得原來2頁的篇幅變的更有條理和可讀性。重點更為突出。文中也對參考文獻進行了更新，不過似乎全文最新的文獻也只到了2016年，從這一點上看似乎這個版本在FDA手上也是壓了有一段時間。個人認為也可以解釋為什么全文中有部分地方與2018的白皮書描述有不一致的地方。

從ADA檢測方法描述中可見新版更加強調(diào)了對于高風(fēng)險產(chǎn)品的case by case原則，全文也是多處提及了要提前與當(dāng)局進行溝通。這也從側(cè)面說明了免疫原性評價時一個綜合評判的過程，對于創(chuàng)新藥物品種，特別是高風(fēng)險的產(chǎn)品從方法選擇到采樣計劃，檢測計劃都需要格外慎重。

從ADA發(fā)生率比較段落描述可見新版對于ADA數(shù)據(jù)的比較體現(xiàn)了非常謹慎的態(tài)度。特殊情況必須進行ADA比較的情況（不同產(chǎn)品，或不同來源）需進行頭對頭的試驗，并且采用對待評價的2個產(chǎn)品具有等同靈敏度和特異性的同一個方法進行檢測。（one assay VS two assays的對決中，似乎one assay贏了）

五、Assay Design Elements部分

新增一段注釋“The bioanalytical scientist should evaluate the applicability ofthese factors and others based on emerging science.  FDA’s thinking on this matter may change as the science evolves. ”

解讀：通過一段注釋給本指導(dǎo)原則留了充足的空間，也給工業(yè)界留了一定的發(fā)揮空間，如果有充足的科學(xué)證明，可以進行適當(dāng)?shù)男薷摹?/span>

A Testing Strategy

1.Multi-Tiered Testing Approach

新增“However, in most cases it is not necessary to empirically determinethe affinity of antibodies that are detected by the initial screening assay.”

解讀：雖然正式版中仍然保留了關(guān)于篩選試驗要能識別低濃度的低親和力和高親和力的ADA的描述，但是新增了一句解釋，說明了其實無需專門的試驗進行證明。這一點上對于實際操作更加有指導(dǎo)意義。

新增“For example, assessment of cross-reactivity may be needed when thetherapeutic protein product belongs to a family of proteins with high homologyand it is important to know whether other family members are affected by ADA.”“Epitope specificity determination of the ADA response is notfrequently performed, although it is common to perform a more generalassessment of domain specificity for multi-domain products such as pegylatedproteins, antibody-drug conjugates, and bispecific antibodies ” 

解讀：正式版中加入了關(guān)于cross-reactivity具體應(yīng)用場景的舉例。使得工業(yè)界能更好的理解并實施。同時也對不常進行的結(jié)合表位確認試驗進行了更多的解釋：除了多結(jié)構(gòu)域產(chǎn)品進行結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分析外，一般不進行結(jié)合表位確認試驗。

2. Immunoglobulin Isotypes or Subtypes 

標(biāo)題及正文多處描述的變化。

解讀：正式版中除了保持免疫球蛋白的同型描述，還在小標(biāo)題中加入了亞型的描述。雖然正文部分未額外添加過多內(nèi)容。對于免疫球蛋白同型和亞型的分析需求主要還是根據(jù)給藥方式及臨床需求決定，一般情況下橋聯(lián)法可以滿足基本的ADA檢測需求，如果需要進行同型分析，IgM和IgG可以滿足絕大部分的需求，IgA的亞型也在部分情況下需要。IgE部分的檢測在難度和靈敏度需求上均有高于其它同型的要求。

在亞型的檢測需求上主要考慮的長期抗原暴露會帶來的IgG4亞型，在VIII因子和EPO產(chǎn)品上尤其需要注意。IgG4亞型也是橋聯(lián)法的“死穴”，因此如果需要考量IgG4需要換方法，如SPR。

3. Domain Specificity

標(biāo)題及正文的重寫

    解讀：此部分直接將draft版中的表位特異性給替換了，轉(zhuǎn)而替換為多結(jié)構(gòu)域產(chǎn)品的描述。與前文呼應(yīng)，弱化了結(jié)合表位的檢測需求。個人認為draft版中的結(jié)合表位確認難度確實較大?，F(xiàn)在改為結(jié)合結(jié)構(gòu)域確認在可操作性上有了較大提高。通過全分子的篩選和確證得到陽性樣本，陽性樣本再進行結(jié)構(gòu)域特異性的分析。此處雖然沒有額外引用文獻，但是基本表達的意思與文獻一致，對于結(jié)構(gòu)域特異性的分析方式主要通過提供不同結(jié)構(gòu)域分子的競爭性試驗進行。后文也對ADC藥物進行了單獨闡述。

B. Assay Cut-Point

第一段一處描述修改“Establishing the appropriate cut-point is critical to minimizing the risk of false-negative results.”（Draft版中為critical to ensuring acceptable assay sensitivity ）

解讀：此部分將保證足夠靈敏度改為限制假陰性率。一處改變個人認為很好的體現(xiàn)了ADA方法的本質(zhì)：基于統(tǒng)計。靈敏度這些都是浮云，得一株好的PC，啥靈敏度達不到。得一株渣PC，縱使酸化，吸附全用也是枉然。只有概率才是永恒。

第三段新增的描述“The statistical approach employed to determinethe cut-point may entail various processes, such as removing statisticaloutliers from analyses, and using an approach to account for pre-existingantibodies.” 

解讀：新調(diào)整的這么一句話，簡明扼要的說清楚了臨界值統(tǒng)計時所需要面臨的主要問題：離群值和預(yù)存抗體。

第四段新增描述“Sponsors should consult with FDA if there is aconcern regarding the exclusion of outliers.”  

解讀：新加入這么一句，是正式版中諸多一旦無法斷定就要和FDA咨詢的一處。從這么多不確定性上也側(cè)面說明了免疫原性的難處。此處充分強調(diào)了離群值判斷時的重要性。剔除了不合適的離群值會導(dǎo)致臨界值的判斷不準確，造成低估的情況。針對不同的樣本群情況需要不同的分析，并不是所有的預(yù)存抗體情況都是離群值。

新增“If subjects in the study have pre-existing antibodies, it may be necessary to assign positive responses using a cut-point based on the difference between individual subject results before and after exposure to identify subjects in whom ADA increases following treatment, alsoknown as treatment-boosted ADA.  A common approach to evaluating treatment-boostedADA responses is to assess changes in antibody titers. ”

解讀：新加入的這么幾句話簡明扼要的講述了存在預(yù)存抗體時如何進行ADA的評價。雖然老版在滴度分析部分有簡要提及，但是新版放在此處個人認為描述更加清楚。

去掉了Draft中“It is possible to arrive at a reasonable value to define assay cut point through careful design consideration, such as utilizing the minimal required dilution (MRD) of thesample, removing statistical outliers from analyses minimizing the impact ofinterfering factors, improving assay drug tolerance, and using an approach toaccount for pre-existing antibodies

解讀：老版中的這句話的確顯的和臨界值這一段不是特別搭。

C. Sensitivity 
  1. Assay Sensitivity 

 新增“Assay sensitivity is assessed using positive control antibody preparations that may not represent the ADA response in a specific subject.  For example, positive controls are frequently developed under conditions that enrich for high affinity antibodies.  Such high affinity positive controls may over estimate the sensitivity of theassay.  Because of this, the assay sensitivity determination contributes to the overall understanding of how the assay performs rather than setting anabsolute mass of ADA that will be detected in any given subject. Becausethe measurement of assay sensitivity can be affected by onboard drug, it isalso important to determine assay sensitivity in the presence of the expectedconcentration of onboard drug”

解讀：新版中的這幾句描述道出了方法靈敏度的真諦：監(jiān)測方法的性能，而非說明具體能測到的ADA量。由于靈敏度很大程度取決于所用的PC質(zhì)量，因此靈敏度說白了只能是從側(cè)面體現(xiàn)一下方法的性能，但是最終能否測出ADA還是需要考慮更多的因素。這里也在提醒工業(yè)界，不要為了靈敏度而刻意去追求參數(shù)。說到底最終目的是為了去測出ADA。基于這個目的，新版中也強調(diào)了其實對于靈敏度更有意義的指標(biāo)是在藥物存在情況下能檢出的ADA情況，也就是藥物耐受情況。關(guān)于新版的這幾句話，實在是不能再贊同了。

新版修改了描述“FDA recommends that screening and confirmatoryIgG and IgM ADA assays achieve a sensitivity of at least 100 nanograms permilliliter (ng/mL) although a limit of sensitivity greater than 100 ng/mL maybe acceptable depending on risk and prior knowledge.” “Assays developed to assess IgE ADA should have sensitivity in thehigh picograms per milliliter (pg/mL) to low ng/mL range. ”

解讀：新版中在100ng/ml靈敏度前加上了適用情況（IgG和IgM），這其實是提高了對于靈敏度這塊的要求，100ng/ml的標(biāo)準不能通吃了。從后文緊接著的關(guān)于IgE的靈敏度要求直接證明了這一點。鑒于IgE的特殊性，靈敏度提升到了ng/ml甚至pg/ml的水平。要求真的很高。這里沒有加入文獻中關(guān)于超靈敏方法（10ng/ml左右）的討論著實有點可惜。

2. Drug Tolerance, Sensitivity, and Assay Suitability  

標(biāo)題中多加入了sensitivity和assaysuitability

解讀：新版的這個改變個人感覺有點畫蛇添足，顯得有點累贅了。

新版中加入了“The selectivity of the assay, the nature of thetarget, and the type of positive control should be taken into considerationwhen developing the assay because these factors impact the assessment of drugtolerance.  For example, acid dissociation may not be appropriate whenantibodies are acid labile or the drug target is soluble. ”

  解讀：新版的這個解釋對于目前改善耐藥性常用的酸化方法提了個醒，酸化方法在藥物性質(zhì)特殊或者靶點性質(zhì)特殊時是不合適的。在改善耐藥的方法選擇時還需要多方位考慮，不能只有酸化一種法子。

 D.Specificity  章節(jié)

變化1：標(biāo)題。

解讀：新版將特異性和選擇性拆開，個人認為又是一個增加可讀性的舉措，老版兩部分揉在一起，讀下來十分考驗人。

變化2：很有意思的一個題外話，引文22。

解讀：引文22，在頁底寫的是“Ibid”。乍一看以為是個typo，細一想，沉淀3年的FDA正式版應(yīng)該不能，網(wǎng)上一搜，果然是自己孤陋寡聞了。原來“Ibid”是個高冷的引用方式，代表跟21引文一樣的意思。這樣一來，引用部分比起draft版一串一模一樣的引用要顯的簡練不知道多少了。真的是活到老學(xué)到老，學(xué)習(xí)了。

變化3：部分描述的添加“In cases where ADA demonstrates cross-reactivity with host cellproteins and other product-related impurities, the specificity of these reactions may need further evaluation. ”

解讀：較老版中添加了一個cross-reactivity的前提，這一添加給特異性的實際操作帶來了更加明確的指示。特異性考察在方法學(xué)考察中是最難把握的，各個指導(dǎo)原則這部分都是寫的比較泛，一方面是想給工業(yè)界留有操作的空間，一方面確實無法詳細規(guī)定。HCP和雜質(zhì)的特異性考察雖然有了提示，不過預(yù)計在實際操作中仍然要具體問題具體對待。畢竟大部分情況下HCP和雜質(zhì)的含量都太低了。

變化4：添加“Establishing the specificity of multimeric antibodies such as IgM by competitive inhibition may be difficult, so establishing assay capability for these circumstances requires careful development or additional approaches.”

解讀：這一添加是正式版中加入各種同型考量的又一處體現(xiàn)，關(guān)于ADA的評價已經(jīng)從各種同型一鍋端到現(xiàn)在需要區(qū)分不同同型的階段了。針對不同同型的研究方法都需要進行特殊的考量。對不同同型的考量需求來自產(chǎn)品在臨床產(chǎn)生的免疫原性相關(guān)的副作用以及副作用產(chǎn)生的時期。需要綜合考量綜合判斷。有時在方法開發(fā)階段無法預(yù)計，在獲得實際受試者樣本后才能得到具體信息，此時需要再去回顧方法，如有必要進行調(diào)整。

變化5：去掉了“For responses to other proteins, an unrelated protein of similar size and charge can be used. ”

解讀：老版中的這一描述不夠準確，且和后文“Controlling Non-Specific Binding”章節(jié)的描述有所重復(fù)。蛋白的干擾考察并不應(yīng)考察對象不同而不同，而是與待測樣本的情況有關(guān)。對抗體類藥物的免疫原性評價同樣也可能需要考察蛋白干擾。因此這一刪除不是說蛋白就無需考察相關(guān)特異性了。

 D. Selectivity  章節(jié)

變化：第一段中大段的語句重組

解讀：新版中的絕對大部分描述在老版中均有描述，但由于原來放在和特異性章節(jié)一起顯的并不清晰。新版單獨拎出來確實更加便于理解。

1．Matrix Interference部分

變化1：語句改變“An important consideration is how the sample matrix (for example, plasma, serum,saliva) can affect assay performance.  Some degree of signal suppression is expected when comparing assay performance in diluent versus matrix.  ” 

解讀：新版中以“sample matrix”替換了老版“assay matrix”。同時也明確指出稀釋液或多或少會對基質(zhì)產(chǎn)生部分信號抑制。因為基質(zhì)中有內(nèi)源性或外源性物質(zhì)干擾。新版的這一改變使得邏輯更為清晰：因為基質(zhì)直接檢測幾乎都會有干擾，因此免疫原性樣本幾乎在測前都需要進行稀釋。

變化2：修改了描述“Various substances inthe matrix, such as free hemoglobin (hemolysis), lipids (lipemia), bilirubin(interus) ” 

解讀：新版中突出了干擾物的舉例，除了常見的溶血，高脂血外還加入了黃疸血。除此隨著聯(lián)合給藥的越來越多，這部分的考察也需要進行關(guān)注。這里加入了黃疸血的情況難道是以后還需要考慮高膽紅素的情況了？這部分還需要再文獻調(diào)研一下。相信FDA不會隨便寫入一個不需要的詞。老版中雖然也有類似描述，但是放的位置以及邏輯性都不是很好。新版讀下來讓我以為這是新加入的，后經(jīng)仔細對比，才發(fā)現(xiàn)老版中也有。

變化3：大量語句的調(diào)整

解讀：新版中除了文字的修改，還將老版基質(zhì)干擾部分的大量描述進行了全新組合。使得前后邏輯性改善了很多。避免了老版讀下來總感覺似曾相識，但是總也找不到的問題。

2. Minimal Required Dilution部分

變化1：“Multiple definitions of MRD have been proposed, including the sample dilution that yields the highest signal-to-noise ratio; the sample dilution that results in a signal closest to assay diluent; and the sample dilution that results in the highest signal to variability ratio” 

解讀：新版中將MRD的定義進行了拓展，提出了3種解釋。即：具有最高信噪比的稀釋倍數(shù)；與稀釋液信號最接近的稀釋倍數(shù)；具有最高信號變量比的稀釋倍數(shù)。對于第三種解釋從新版看寫的較模糊，從字面不好理解。不過好在有引用文獻。查看文獻后發(fā)現(xiàn)第三種解釋指的是需要平衡基質(zhì)效應(yīng)，靈敏度等參數(shù)。此處的定義拓展使得在確定MRD時的靈活性更大?？偟膩碚f還是為了試驗數(shù)據(jù)的科學(xué)性。

變化2： 精簡了語句“Higher MRD may result in false-negative responses. ” 

解讀：新版中的這句話用最精煉的語句表達出了最準確的意思：MRD高了就會有假陰性。對于免疫原性檢測方法需要提高假陽性率，降低假陰性率。因此在MRD選擇時只要能滿足要求即可，切不可盲目追求數(shù)值。根據(jù)文獻和經(jīng)驗一般MRD在1：20~1：50為宜。特殊情況下超過1：100的MRD一定要謹慎評價靈敏度降低對檢測帶來的影響。

F. Precision章節(jié)

變化：增加了“In cases  where a floating cut-point is needed, inter-assay precision may be calculated using normalized values”

解讀：新版中增加的這句話體現(xiàn)出了新版在可操作性方面的加強。對于采用浮動臨界值的情況，如果還是用原始數(shù)值進行精密度的計算和評估，十有八九都達不到FDA的20%的要求。不過如果應(yīng)用均一化后的數(shù)值來進行評估，這個標(biāo)準的可執(zhí)行性就高了很多，而且也更科學(xué)了。

G. Reproducibility章節(jié)

變化：調(diào)整了描述“Comparable assay performance, including sensitivity, drug tolerance, and precision, should be established between laboratories. ”

解讀：新版中這句調(diào)整在老版只強調(diào)了精密度的基礎(chǔ)上添加了更為廣泛的要求：要求方法的參數(shù)具有可比性。除了精密度還有靈敏度，藥物耐受等數(shù)據(jù)。這個變化想必也是基于免疫原性數(shù)據(jù)的比較需要謹慎的原因。不同實驗室間的數(shù)據(jù)要進行對比僅僅滿足精密度的確是不夠的。要確保方法的全方位一致，才能將不同實驗室間的數(shù)據(jù)進行橫向?qū)Ρ龋駝t風(fēng)險過大。

H. Robustness and Sample Stability章節(jié)

變化1：添加了“Some aspects of robustness may be included in the assay validation exercise ”

解讀：新版中添加的這句可以認為是一個關(guān)于方法穩(wěn)健性的強調(diào)。免疫原性由于其半定量及基于統(tǒng)計的原理，使得方法的穩(wěn)健性對于數(shù)據(jù)質(zhì)量有著至關(guān)重要的作用。在方法開發(fā)和驗證中需要有效識別關(guān)鍵性的參數(shù)，避免在臨床長期的樣品檢測期間造成數(shù)據(jù)的波動。

變化2：關(guān)于穩(wěn)定性的解釋“Because it is generally not feasible to establish the stability of subject samples”

解讀：新版中添加的這句可以視為對于免疫原性穩(wěn)定性驗證的正名。為何要去做穩(wěn)定性：因為無法準確獲知真實樣品中實際的穩(wěn)定性，所以需要用陽性對照抗體進行外加模擬。這個穩(wěn)定性的作用如何：有用，但是因為外加的陽性對照抗體無法預(yù)測體內(nèi)樣本的真實情況，甚至陽性抗體本身其實也無法代表體內(nèi)真實的抗體情況（例如，親和力，組成等）。這種穩(wěn)定性的考量雖然作用有限，但是也是無奈之舉，算是對體內(nèi)復(fù)雜情況的一種妥協(xié)。

變化3：大幅修改了穩(wěn)定性考察的描述“ FDA recommends that sponsors minimize freeze-thaw cycles by appropriately aliquoting subjects’ samples because freezing and thawing such samples may also affect assay results.  However, studies evaluating short-term stability, including, as relevant, freeze-thaw cycle and refrigerator- and room-temperature stability of positive control antibodies, may be useful.   ”

解讀：新版中的修改一方面增加了如何減少凍融循環(huán)的操作建議：增加分裝。另一方面，終于將老版中長期穩(wěn)定性的考察要求替換為短期穩(wěn)定性考察：凍融，短期存放溫度的穩(wěn)定性考察。此處的改變相信讓大家都會拍手稱快。穩(wěn)定性對于ADA來說可以說形式大于意義，尤其是長穩(wěn)的考察。多篇白皮書已經(jīng)提出長穩(wěn)考察的不必要性，F(xiàn)DA終于在新版中跟進了。

I. Selection of Format 章節(jié)
  變化1:新增了“Bridging assay formats may be subject to false-negative results when the antigen (for example,PEG) has repetitive motifs.” 

 解讀：新版中加入的這句算是在提醒工業(yè)界ADA的檢測方法遠沒有看上去這么簡單，想“橋聯(lián)法”一招鮮在目前藥物靶點越來越新的情況下是越來越難了。在選擇檢測方法時除了考慮藥物自身的性質(zhì)同時，也需要對藥物作用機理及作用通路進行充分的調(diào)研，避免在驗證中“一帆風(fēng)順”，在測樣中“折戟沉沙”。

    變化2:新版刪除了“All assays should be evaluated for their ability to detect  rapidly dissociating antibodies such as IgM,which are common in early immune responses. Failure to detect such antibodies in early immune responses to therapeutic protein products may result inunder-detection of true-positive antibody samples. ”

解讀：新版中的這個改變相信與前文區(qū)分抗體同型有密切的關(guān)系。既然不同抗體同型的考量都不一樣，自然就不存在所有方法都需要檢出IgM一說了。不過這句話的刪除并不代表不需要考量IgM，相信只是強調(diào)需要“對癥下藥”。后文對于如何考量IgM還是提出了可執(zhí)行的建議。

J. Selection of Reagents章節(jié)

變化：概述中加入了“Qualification and stability of critical reagents is important for ensuring consistent assay performance. ”

解讀：新版中再次強調(diào)關(guān)鍵試劑的重要性。相信這也是想讓工業(yè)界把基本功做扎實。要轉(zhuǎn)變觀念，不能為了驗證而驗證。后文有提及驗證其實分為三個階段：開發(fā)，方法學(xué)，測樣。方法學(xué)驗證只是其中一個環(huán)節(jié)，測樣階段對于陽性對照的持續(xù)監(jiān)測才是驗證環(huán)節(jié)中更為重要的環(huán)節(jié)，也是風(fēng)險最大的環(huán)節(jié)。為了數(shù)據(jù)的質(zhì)量，需要嚴控試驗的各個環(huán)節(jié)，尤其是關(guān)鍵試劑。

1.Development of Positive Control Antibodies部分

變化1：增加了舉例“When the positive control antibody is not detectable by that same reagent (for example, if the positive control is generated in a rabbit and a different secondary reagent is needed to detect the positive control antibody), a positive control antibody for the secondary reagent used to detect human antibodies in the subject samples also should beincluded in the assay to ensure that the reagent performs as expected.”

解讀：新版的這個舉例算是在給這段晦澀難懂的用直接法檢測ADA的描述嘗試性的在減低難度。老版這段就不是很清晰，現(xiàn)在雖然加入了例子，但是似乎這段依然不是很清晰。只能說，一定要想法設(shè)法避免用直接法檢測ADA，能用橋聯(lián)法的一定要用橋聯(lián)法。

變化2：大幅精簡了語句“ For therapeutic mAb, the sponsor should select a positive control antibody that binds to the variable region of the therapeutic mAb. ”

解讀：新版將老版中的一小段話直接精簡到一句。讀下來還是喜歡老版更為詳細的解釋。新版的這一句雖然也是精準到位，只是少了些來龍去脈。

2.Development of Negative Control部分

變化1：兩段話位置進行了更換

解讀：新版這一調(diào)整個人認為還是增加了可讀性的。

變化2：段前和段后分別新增“When possible, negative control samples should be collected from treatment-na?ve subjects with the medical condition being studied”及“If cut point and selectivity differ when negative controls from different populations are used, reevaluating other assay parameters (for example, sensitivity) may be needed.  ”

解讀：新版加入的這兩句話更具體更具操作性。此處所強調(diào)需要具有同樣機體狀態(tài)。對于臨床的實際情況中，尤其是在患者身上的臨床試驗，想要按照這個要求進行，難度頗大。正文部分提出了可執(zhí)行的操作方式，即：用商業(yè)來源或者健康人的基質(zhì)進行方法驗證。但是方法的重要參數(shù)需要在真實患者給藥前基質(zhì)可用時進行確認。如果重要參數(shù)真的有差異，那么需要用真實基質(zhì)進行重新的方法評估或者驗證。

3.Controlling Non-Specific Binding部分

變化：去掉了“Detection reagent consideration”

解讀：老版中這個小節(jié)的內(nèi)容的確是有些雞肋，在方法選擇部分有重疊，刪除也是為了使得全文更連貫。非特異性結(jié)合小節(jié)的內(nèi)容在實際操作中更多需要根據(jù)經(jīng)驗進行靈活操作，具體問題具體分析。不像其它部分有明確的接受標(biāo)準。這塊就是“屬于師傅領(lǐng)進門，修行靠個人”

J. Reporting Results for Qualitative and Quasi-QuantitativeAssays 章節(jié)

變化：語句的大量調(diào)整。

解讀：對于免疫原性結(jié)果的表達方式分為定性和半定量兩種方式。定性往往用于無需與安全性和有效性建立分級聯(lián)系的情況。但凡需要與安全性和有效性建立統(tǒng)計關(guān)聯(lián)時就需要采取半定量的方式進行結(jié)果表達。一般ADA采用滴度進行半定量表達，NAB采用單位體積基質(zhì)中可中和的藥物濃度進行半定量表達。盡量避免用質(zhì)量單位這種絕對定量的方式進行結(jié)果表達。因為體內(nèi)的ADA情況至少在目前是無法準確定量的。

I.OtherConsiderations for Assay Development章節(jié)

1.Pre-Existing Antibodies部分

變化1：刪除了關(guān)于預(yù)存抗體來源的描述

解讀：隨著近幾年關(guān)于預(yù)存抗體文獻的增多，工業(yè)界對于預(yù)存抗體的廣泛存在已有共識。因此老版中關(guān)于預(yù)存抗體來源的描述顯的有些多余。這個改變也是科學(xué)不斷發(fā)展所帶來的。

變化2：增加了“When there are pre-existing antibodies and the titer of antibodies increases after exposure to the therapeutic protein product, they can be reported as treatment-boosted to differentiate them from treatment-induced antibody titers.  For example, a boosted ADA response may be defined as a titer that is two dilution steps greater than thepre-treatment titer, when twofold dilutions are used to determine the titer.”

解讀：新版中增加的關(guān)于出現(xiàn)預(yù)存抗體如何進行分析的描述使得這種處理方式得到了法規(guī)的支持。在增加的描述中較老版不同之處是在正文中加入了“treatment-induced”的概念。比較遺憾的是沒看到文獻中出現(xiàn)的“treatment-unaffected”的概念。這三個概念分別對應(yīng)于給藥前沒有，給藥后出現(xiàn)；給藥前有，給藥后增強；給藥前有，給藥后無明顯變化。正是由于免疫原性的復(fù)雜性，所以才有了如此細的區(qū)分。

2.Rheumatoid Factor部分

變化：僅文字描述的完善

解讀：老版中關(guān)于RF的討論已經(jīng)較為完善，新版的確無太多可加的部分。僅僅進行了部分描述的完善，使得描述更為準確。

3.Monoclonal Antibodies部分

變化1：刪除了關(guān)于動物來源單抗的描述。

解讀：新版中這些描述的刪除屬于與時俱進的一部分。在現(xiàn)在再談動物來源的單抗的確過時了。

變化2：語句的改變“ If the Fc region is engineered or bound to another molecule, an assay that characterizes this response may beneeded.”

解讀：新版中改變了老版中“Fc-fusion proteins”的描述，改為了更廣泛的“bound to another molecule”。相信這是為了覆蓋現(xiàn)在的雙抗和其它類型的工程抗體。

4.Conjugated Proteins部分

變化：僅少量文字的完善

解讀：老版中關(guān)于ADC的討論已經(jīng)較為完善，新版幾乎未做修改。僅僅刪除了關(guān)于標(biāo)記的需要注意的描述。相信這個改變是因為目前的標(biāo)記技術(shù)還是可以滿足檢測要求的。所以這個提醒似乎是沒有實際作用的，因此新版進行刪除也是合理的。

一、Assay Development部分

A. Development of Screening Assay  章節(jié)

變化：修改了方法開發(fā)中所需要用到的個體數(shù)量及可接受假陽性率。

解讀：新版中將方法開發(fā)中所需要用到的個體數(shù)量從老版的“10”個改為了“5~10”，同時明確了篩選試驗開發(fā)時的可接受的假陽性率“5%”。這2個改變使得新版更具執(zhí)行性。老版的10個要求太過死板。有的時候為了達到這個要求要多做一塊板的開發(fā)。

B. Development of Confirmatory Assay  章節(jié)

幾乎無變化

C. Development ofTitration Assay  章節(jié)

變化：刪除了Titer的定義及計算方式。

解讀：新版的這一精簡使得全文更連貫，不過對于以新版入手的同仁可能會有額外的疑問。另外新版中關(guān)于ADA的titer差異的判斷描述“a boosted ADA response may be defined as a titer that is two dilution steps greater than the pre-treatment titer，when twofold dilutions are used to determine the titer”還是略微粗糙甚至有些誤導(dǎo)。即使在后文的驗證描述中也未進行拓展描述。關(guān)于滴度差異的判斷僅僅以稀釋倍數(shù)來比較顯的還是武斷了些。根據(jù)文獻的闡述，更為準確的比較方式是需要根據(jù)驗證中滴度試驗的差異進行判斷，雖然在一個波動小的試驗體系中，滴度的差異往往在一個稀釋倍數(shù)以內(nèi)，但在波動大的試驗體系中，滴度差異可能會超過幾個稀釋倍數(shù)的范疇。還是建議大家在滴度驗證中考量方法的波動性再做判斷。

D. Development ofNeutralization Assay  章節(jié)

概述的變化：添加了中和抗體試驗的可替代試驗描述“In selected cases,where there is a highly sensitive PD marker or an appropriately designed PK assay or both that generate data that inform clinical activity, it may be possible to use these in lieu of a Nab assay. This determination should be donein consultation with the Agency. ”

解讀：新版中加入的這個可替代中和抗體試驗的PK和/或PD試驗屬于意外之喜。雖然最后還是加入了要慎重選擇，需要與FDA溝通的描述，不過這也可以視為中和抗體檢測試驗方法的開放，畢竟中和抗體試驗是以目的為導(dǎo)向的，只要能檢測出臨床活性變化即可。這塊的具體操作方式相信還需要一段時間在工業(yè)界的嘗試才能得到大面積的采用。

1.Selection of Format for Neutralization Assay部分

變化：新版中進行了部分語句的調(diào)整。

解讀：新版中根據(jù)文獻將non-cell-based試驗進行了拓展：non-cell-based并不是完全等同于LBA，還包括酶活試驗。這一改變應(yīng)該是沖著大家的固有觀念去的。相信大部分同仁心里想的non-cell-based試驗就是LBA。新版中和抗體試驗的推薦方法仍然是cell-based試驗，這塊與最新的文獻有所出入，畢竟大部分時候開發(fā)一個穩(wěn)健的cell-based中和抗體方法有很大的難度。這塊的要求不知道會不會隨著新的工業(yè)界討論而改變。無論怎樣，就像新版中所說，中和抗體方法的選擇和開發(fā)還是需要基于MOA。

2.Activity Curve of Neutralization Assay部分

變化：調(diào)整了部分語句順序和描述

解讀：新版中的語句調(diào)整使得此部分的可讀性大幅增加，前后邏輯強了很多。在活性曲線示意圖中增加了低平臺區(qū)的注釋。對于中和抗體試驗往往可以采用藥企生產(chǎn)中的放行活性檢測試驗。但是兩者還是有著較大的區(qū)別。在中和抗體試驗中由于考察的是ADA是否會影響藥物活性，需要首先根據(jù)活性曲線找到最適合進行活性考察的藥物濃度，其次由于中和抗體檢測時往往無法回避基質(zhì)效應(yīng)的影響。因此對于放行的活性檢測試驗仍然需要進行調(diào)整和優(yōu)化才能用于中和抗體試驗。

3.Considerations for Matrix Interference for Neutralization Assay部分

變化：新增兩句描述“choose a cell line that is specifically activated by the therapeutic protein product. Alternatively, the interfering factors can be inhibited or depleted by using a specific antibody or a cellline that specifically responds to drug treatment”

解讀：新版中對存在基質(zhì)干擾的情況提出了較為明確的解決方式，增加了工業(yè)界的可操作性。不過由于活性試驗受到的影響因素較多，且試驗體系波動較大，因此即便有FDA的建議，解決基質(zhì)效應(yīng)仍然是個難題。

4．Cut-Point ofNeutralization Assay部分

變化：新增描述“Most frequently fixed  cut-points are established for Nab assays where, depending on the mechanism of action of the drug, a threshold percent inhibition or stimulation of signal is established, but floating cut-points may be used” 

解讀：新版中非常意外的直接寫出了中和抗體試驗的臨界值確認原則：推薦采用以抑制率或激活率計算得到的固定臨界值。這一描述的增加無疑又是給中和抗體降低難度，對工業(yè)界是好消息，更容易執(zhí)行了。不需要像篩選臨界值那樣進行復(fù)雜的統(tǒng)計和剔除。

5．Additional Consideration for Neutralization Assay部分

變化1：描述的少量修改 

解讀：對于NAb試驗，由于樣品已經(jīng)經(jīng)過了篩選，確證的過程，因此NAb試驗往往無需額外的再確證過程，只有特殊的情況才需要進行。在NAb試驗中需要額外注意的部分集中在活性試驗的特異性上，如何排除基質(zhì)干擾及如果選擇特異性更高的活性試驗是NAb試驗的難點，需要Case-by-case 分析。

變化2：新增一小段關(guān)于藥物濃度的考量描述

解讀：這句話的加入增加了NAb部分完整性。對于NAb試驗，與篩選和確證試驗一樣，都會受到藥物濃度的干擾。如何有效避免藥物的存在對試驗的影響是免疫原性評價始終繞不過去的坎。

二、ASSAY VALIDATION章節(jié)

概述部分

變化：新增“High-risk products may require full validation before any clinical studies”

解讀：新版中強調(diào)了對于高風(fēng)險產(chǎn)品的驗證要求。由于高風(fēng)險產(chǎn)品的危險性更大，因此在臨床試驗前就需要對方法有更為全面的驗證，以獲得更為準確的結(jié)果，降低臨床應(yīng)用的風(fēng)險。對于普通風(fēng)險產(chǎn)品的驗證可以隨著臨床試驗的進展而逐步完善。對于高風(fēng)險產(chǎn)品對藥企提出了更高的要求。藥企需要盡早與監(jiān)管機構(gòu)及CRO公司溝通，以在臨床試驗正式啟動前建立全面驗證的ADA檢測方法。切不可臨時抱佛腳。

A．General Considerations for Assay Validation 部分

變化1：將“Validation includes all of the procedures that demonstrate that a particular assay used for quantitative measurement of ADA in a given sample is reliable and reproducible for the intended use.” 精簡為“Validation includesassessments that demonstrate that an assay used for measurement of ADA is suitable for the intended purpose”

解讀：新版描述除了更簡潔準確，同時也更體現(xiàn)了ADA分析case by case的原則，而老版中僅僅體現(xiàn)出ADA分析的部分需求，略顯片面。

變化2：增加了 “in-use stability of critical reagents.”

解讀：新版驗證要求中增加了關(guān)鍵試劑例如標(biāo)記的試劑等的穩(wěn)定性驗證要求。雖然老版中在方法穩(wěn)健性中也有部分描述，新版單獨強調(diào)也體現(xiàn)出關(guān)鍵試劑的檢測對于方法的驗證及使用的重要性。特別對于臨床免疫原性試驗往往周期較長，如果不能很好的監(jiān)測關(guān)鍵試劑，那么驗證和樣本分析中的方法將會脫節(jié)。

變化3：增加了”Balanced study designs should be used for cut-point determination. If plate homogeneity of response is not demonstrated, alternative plate layouts should be used during cut-point determination.”

解讀：新版在cut point計算中增加了試驗設(shè)計的要求。對于ADA檢測最為重要的參數(shù)之一就是臨界值，臨界值是否能夠準確制定是決定分析結(jié)果準確性的關(guān)鍵因素。在文獻討論中提出了臨界值試驗的設(shè)計要求，此次在新版法規(guī)中進行添加也是將此設(shè)計要求規(guī)范化，提高了對臨界值制定的統(tǒng)計要求。

變化4：在獲得真實樣本后的處理方式上有一個重要單詞的變化“the cut point should be determined again” 變成了“the cut-point should be confirmed.”

解讀：新版在實際樣品基質(zhì)與方法學(xué)驗證中所采用基質(zhì)不同的情況下，將cut point 的計算從“determin”變?yōu)椤癱onfirm”，新版描述更為科學(xué)合理，易于操作。在臨床試驗中真實基質(zhì)往往無法達到臨界值驗證時對于個體基質(zhì)的要求，老版中要求用真實基質(zhì)進行重新計算，新版則為進行評估。真實基質(zhì)與商售基質(zhì)在臨界值的差異需要通過試驗來證明，其結(jié)果可能為相同，也可能為不同，僅在不同的情況下才需要對臨界值進行重新計算。

變化5：精密度描述部分大量語句的調(diào)整。

解讀：在新版中的描述邏輯性更好。雖然新版中仍然維持了老版中一般情況20%的精密度要求，不過由于前文添加的數(shù)據(jù)均一化建議，20%雖然要求較高，特別對于陰性對照及低濃度的陽性對照。但是經(jīng)過均一化和方法的優(yōu)化這一要求也具有一定的可操作性。不過個人還是20%略高。

B． Validation of Screening Assay部分

變化1：刪除空白個體數(shù)目要求，從原來的必須采用最少50個，變?yōu)椤癮n appropriate number of treatment-na?vesamples, generally around 50.”；同時cut point的計算進行了一定的指導(dǎo)，即增加“ When using the approach published by Shen et al., the reportable value for each sample should be the average of the six measurements.”

解讀：從空白個體數(shù)目選擇的問題，可以看出FDA還是進行了重新的考量，畢竟在臨床實踐中并不是每個population或者疾病狀態(tài)都能得到50個個體，該處改變更加合理。實際操作中往往通過盡量多的商售個體進行方法的建立和驗證，在獲得真實個體基質(zhì)后再進行臨界值的橋接，如果橋接不上再以真實個體基質(zhì)進行部分驗證以確定新的臨界值。篩選臨界值計算新版仍然維持了老版需要加上置信區(qū)間的描述，置信區(qū)間的加入增加了數(shù)據(jù)統(tǒng)計的難度，不過從科學(xué)性上可以提高假陽性率，使得檢測結(jié)果更加準確。

變化2：較老版增加了fixed cut-point 及dynamic cut point的缺點描述，并表明應(yīng)使用floating cut-point，“a floating cut-point and is the most common type of cut-point used.”

解讀：新版對于明確選擇floatingcut-point的描述，是符合目前工業(yè)界的通行做法。dynamic cut point幾乎只是理論上的可能，操作性不佳，而且一旦出現(xiàn)幾乎意味著方法不佳，需要重新優(yōu)化。fixed cut-point雖然便于操作，但是考慮到ADA方法自身的特點，此方法還是不夠穩(wěn)當(dāng)。在50個樣本量的實際操作中大部分的臨界值制定都是符合floating cut-point的，而且由于此方法可以很好的兼容測樣過程中數(shù)據(jù)的波動，因此應(yīng)用廣泛。

C．Validation of Confirmatory Assay 部分

變化1：主要更改了cut point的統(tǒng)計方法，從原來的“:an 80% one-sided lower confidence interval for the 99th percentile is recommended.”變?yōu)椤癘ne approach for the estimation of the confirmatory assay cut-point is to use an 80% to 90% one-sided lower confidence interval for the 99th percentile.”；

解讀：該部分confirmatoryassay cut point的計算修改后更加靈活；在實際應(yīng)用過程中，確實會出現(xiàn)由于驗證中空白個體差異原因，導(dǎo)致所得確證臨界值不合適的情況，使得臨床樣本檢測出的結(jié)果不符合真實情況；新版中留下的這10%的空間可以根據(jù)實際情況進行靈活選擇。

變化2：在計算cut point的時候，為采用99.9%的百分位數(shù)留下了空間，即“The use of tighter false-positive rates such as 0.1% is not recommended, but may be acceptable for larger studies.”

解讀：新版的這一改變相信也是根據(jù)近幾年越來越多的臨床經(jīng)驗積累而做出的?？偟膩碚f，對于ADA檢測屬于case by case原則，限制太多可執(zhí)行性就會差。不過對于工業(yè)界，在采取特殊的計算方式時一定要是基于科學(xué)的判斷。

D.Validation of Titration Assay 部分

變化：在新版文中增加了以下描述“When the titration assay is not used for screening, the cut-point may be established using a 0.1% false-positive rate. When the titration assay is used for screening (for example, when the subject population has a high incidence ofpre-existing ADA), the cut-point should be established using a 5% false-positive rate.”

解讀：較老版，新版的這一改變幾乎等同于說滴度也需要單獨計算臨界值了。從實際操作中，確實存在如果滴度臨界值直接采用篩選臨界值，而篩選臨界值又落在滴度曲線低平臺區(qū)時，無論稀釋多少倍都很難得到滴度值的情況。這種情況下往往滴度臨界值會人為進行提升（即采用更低的假陰性率去計算）。

E.Validation of Neutralization Assay部分

變化：較老版，增加了“The assessment of assay sensitivity can be affected by the kind of positive control that is used (for example, mAb or polyclonal antibody), how variable the assay is, and how the assay cut point is determined”

解讀：強調(diào)了中和抗體檢測中靈敏度驗證的問題，對于中和抗體試驗由于其基于MOA，不同產(chǎn)品的檢測策略都不相同，因此與篩選試驗不同，新版未給出具體的靈敏度建議。不過在USP中建議NAb試驗達到0.5~2ug/ml的靈敏度。在新版中關(guān)于NAb的描述依舊不夠詳細。如果需要進行NAb試驗的同仁建議參考USP版本。

三、IMPLEMENTATION OF ASSAY TESTING

A. Obtaining Subject Samples

變化1：將IgG的樣本采集建議時間從“4 to 6 weeks after the first exposure”改成了“3 to 6 weeks after the first exposure” ,同時增加了“IgA responses may peak earlier than IgG responses, at around 2 to 3 weeks after antigen exposure . ”

解讀：新版應(yīng)該是根據(jù)文獻對IgG要求進行了修改。同時基于對同型考量的關(guān)注，加入了IgA的采樣建議。IgM屬于較快產(chǎn)生，親和力不高的同型，對其進行檢測在采樣時間點及方法優(yōu)化上都需要額外注意。IgG屬于ADA中的主要組成部分，采樣和檢測相對常規(guī)。IgA屬于特殊情況的特殊考量。在臨床采樣設(shè)計中需要根據(jù)待評價藥物免疫原性風(fēng)險及作用機理進行靈活的判斷，以獲得盡量多的信息。

變化2：”For products with long half-lives, samples should be obtained approximately five half-lives after last exposure. When there is a high risk of serious consequences from ADAs, sponsors should plan to collect samples from subjects until ADAs return to baseline levels. ”

 解讀：新版提到了對于半衰期長及高風(fēng)險的藥物應(yīng)該如何定采血點。對于生物技術(shù)藥物的ADA評價往往需要克服高濃度的藥物干擾，一方面可以提高方法的耐藥性，另一方面可以通過盡量晚的樣品采集時間來降低藥物濃度。對于高風(fēng)險藥物的ADA評價臨床需要進行ADA產(chǎn)生時程的完整觀察（需要通過合適的采樣計劃觀察到ADA的產(chǎn)生，增強，維持，下降等過程），以確定ADA產(chǎn)生的風(fēng)險。

變化3：對于臨床中較難獲得藥物干擾較低的樣本的描述進行修改，增加了 “the sponsor should take additional measures to ensure that the assay is sensitive in the presence of expected onboard drug ”

解讀：新版中增加了方法靈敏度的要求。對于ADA采樣點的設(shè)計，幾乎無法避免藥物干擾，為了準確進行ADA的檢測，需要做的就是要盡可能提高藥物耐受程度，從而獲得盡量真實的結(jié)果。

變化4：對于免疫抑制劑藥物采血點的選擇從“sponsor should obtain samples from patients who have undergone a washout period either because thetreatment phase has ended or because the patient has dropped out of the study.” 變成了“the sampling schedule should be adjusted in accordance with the immunosuppressant regimen, to the extent possible. ”

解讀：新版中對于免疫抑制劑藥物的采血點的選擇要求，刪除了部分老版的描述，個人認為是因為免疫抑制劑情況太過復(fù)雜，具體規(guī)定較難，因此留了個口子。這塊還需要從文獻中獲得更為準確的信息。

B. Concurrent Positive and Negative Quality Controls

幾乎沒變化。

解讀：QC的作用是為了在驗證完后繼續(xù)通過已知水平的陽性對照抗體來監(jiān)測試驗體系。通過驗證建立已知水平陽性對照的可接受標(biāo)準，在樣品檢測時通過這個標(biāo)準對樣品檢測期間的體系波動情況進行監(jiān)測。

C. Confirmation of Cut-Point in the target Population

幾乎沒變化。

解讀：對于臨床ADA的檢測，幾乎無法在驗證中獲得與臨床試驗情況相同的個體基質(zhì)。因此對于目標(biāo)群體中臨界值的確認十分重要，否則就會出現(xiàn)驗證與測樣完全脫節(jié)的情況。

四、DOCUMENTATION章節(jié)

變化：該部分幾乎重寫。提出了Immunogenicity Summary Report并包括以下內(nèi)容：(1)Immunogenicity Risk Assessment, (2) Tiered Bioanalytical Strategy and Assay Validation Summaries, (3) Clinical Study Design and Detailed Immunogenicity Sampling Plans, (4) Clinical Immunogenicity Data Analysis, and (5) Conclusions and Risk Evaluation and Mitigation Strategies (REMS).

解讀：新版對于企業(yè)如何進行藥物免疫原性的報告進行了較為詳細的建議從早期藥物開發(fā)貫穿藥物研發(fā)到上市后的整個過程，以便于更好地評估藥物的免疫原性。對于Immunogenicity Summary Report的建立，在2018版白皮書上就有提及，在新版指導(dǎo)原則中更加細化。以上內(nèi)容的細化，一方面表明FDA從多年實踐中總結(jié)經(jīng)驗，認為原來的申請模式已經(jīng)不再方便適用，建立Immunogenicity Summary Report更有利于監(jiān)管機構(gòu)進行核查與監(jiān)管，也有利于企業(yè)的申報；另一方面FDA強調(diào)了應(yīng)評估免疫原性對藥物PK PD等的影響，更加重視藥物的安全性及有效性，畢竟一個藥物能否上市安全有效才是重中之重。

五、Appendix章節(jié)

變化：新增流程圖

解讀：該流程圖與EMA指導(dǎo)原則文末的流程圖有異曲同工之意。只是FDA在部分詞語描述上做了修改。將“Negative/Positive”的描述改為了“Reactive”。比較有意思，F(xiàn)DA的這個描述幾乎是滴水不漏，因為檢測方法的原因總會有假陰性和假陽性的存在，不知道FDA是不是出于這個點改用了這個詞。