流式細(xì)胞儀的概念
流式細(xì)胞儀的發(fā)展歷史
流式細(xì)胞儀的特點
流式細(xì)胞儀的檢測范圍
流式細(xì)胞儀的分類
流式細(xì)胞儀的基本原理
流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)
流式細(xì)胞儀的測試方法
流式細(xì)胞儀的應(yīng)用
流式細(xì)胞儀選型的關(guān)鍵參數(shù)
流式細(xì)胞儀的實驗流程
流式細(xì)胞儀的品牌信息收集

1.流式細(xì)胞儀的概念

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry , FCM）：

是一種定量分析技術(shù)，是指利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞特異性標(biāo)記熒光信號而測定細(xì)胞的多種生物物理性質(zhì)的方法，同時也是一項可以把具有某相同熒光信號特性的某些細(xì)胞亞群從多細(xì)胞群體中分離和富集出來的細(xì)胞分析技術(shù)。

流式細(xì)胞儀(flow cytometer)：

是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)和抗原抗體檢測技術(shù)為一體的新型高科技儀器。

是以激光為光源、檢測生物學(xué)顆粒理化性質(zhì)的儀器。

生物學(xué)顆粒包括大的免疫復(fù)合物、DNA、 RNA、染色體、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、病毒顆粒、細(xì)菌、真菌、真核細(xì)胞、雜交細(xì)胞、聚集細(xì)胞等。

理化性質(zhì)包括細(xì)胞大小、細(xì)胞形狀、細(xì)胞膜完整性、胞漿顆?；潭?、DNA含量、總蛋白含量、酶活性等。

2.流式細(xì)胞儀的發(fā)展歷史

1934年，Moldavan使懸浮的紅細(xì)胞從一個毛細(xì)玻璃管中流過，每個通過的細(xì)胞可被一個光電裝置記錄下來。這就是流式細(xì)胞儀的雛形。

1965年，Kamentsky用紫外吸收和可見光散射兩個參數(shù)同時測量未染色細(xì)胞，給出細(xì)胞中核酸的含量和細(xì)胞大小。奠定了多參數(shù)流式細(xì)胞測量的基礎(chǔ)。

1967年，Van Dilla和Los Alamos采用了層流流動室和氬激光器，開發(fā)出了液流束、照明光軸、檢測系統(tǒng)三者相互垂直的流式細(xì)胞儀。這成為目前各種流式細(xì)胞儀的基礎(chǔ)。

1969年，F(xiàn)ulwyler利用靜電墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術(shù)，建立了流式細(xì)胞分選術(shù)。

Ehrlich和Wheeless利用飛點掃描技術(shù)和縫掃描技術(shù)使零分辨率的流式細(xì)胞儀變成了低分辨率的流式細(xì)胞儀。

20世紀(jì)70年代，隨著Kohler和Milstein成功提出了單克隆抗體技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)，為特異研究和分析細(xì)胞奠定了良好的基礎(chǔ)。

1973年，美國BD公司和美國斯坦福大學(xué)合作，研制開發(fā)并生產(chǎn)了世界上第一臺商用流式細(xì)胞儀FACS I。

20世紀(jì)80年代，流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)采集、存儲、顯示、分析日趨完善，隨著樣品制備方法的增加，新的熒光染料和細(xì)胞標(biāo)記物的出現(xiàn)，使流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍逐漸擴大。

20世紀(jì)90年代，與之配套的標(biāo)本制備儀和自動進(jìn)樣器的問世，以及適合臨床應(yīng)用的單克隆抗體的增加，使流式細(xì)胞儀逐漸從科研單位進(jìn)入醫(yī)院的中心實驗室和檢驗科，成為現(xiàn)代化的臨床檢驗儀器的一部分。

目前，流式細(xì)胞儀同時朝著更加專業(yè)化和更加普及化的兩個不同的方向發(fā)展。

更加專業(yè)化是指儀器更精密、更靈敏地進(jìn)行更多參數(shù)的分析和更快、更純地進(jìn)行細(xì)胞分選。

更加普及化是指儀器更易于使用，使之成為實驗室里更常用的儀器。

3.流式細(xì)胞儀的特點

FCM與其他細(xì)胞分析技術(shù)相比，有如下特點：

高速度：每秒可檢測1 000~5 000個細(xì)胞。

高靈敏度：每個細(xì)胞只要帶有1 000~3 000個熒光分子就能檢出，兩個細(xì)胞之間有5%的差別就可區(qū)分出來，光散射的靈敏度為0.3um。

高精度：在細(xì)胞懸液中測量細(xì)胞，比其他分析技術(shù)的變異系數(shù)更小，分辨率高。

高純度：分選細(xì)胞的純度可大于99%以上。

多參數(shù)：可同時定量檢測單個細(xì)胞的DNA等多個參數(shù)。

在適當(dāng)?shù)臈l件，可對活細(xì)胞進(jìn)行無害性分析和分選。

4.流式細(xì)胞儀的檢測范圍

檢測范圍：凡細(xì)胞內(nèi)能進(jìn)行熒光標(biāo)記的成分或變化都可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

5.流式細(xì)胞儀的分類

根據(jù)功能不同，可分為臨床型和綜合型（科研型）。

根據(jù)有無細(xì)胞分選功能，可分為流式細(xì)胞分析分選儀和流式細(xì)胞分析儀。

根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，可分為一般流式細(xì)胞儀（零分辨率流式細(xì)胞儀）和狹縫掃描流式細(xì)胞儀（高分辨率流式細(xì)胞儀）。前者的激光光斑為橢圓形，光斑直徑大于被檢細(xì)胞體積。后者激光光束為一條線狀扁平光斑，直徑在3~5um。

6.流式細(xì)胞儀的基本原理

1、將懸浮分散的單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后，放入樣品管。

2、在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細(xì)胞懸液形成樣品流垂直進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動室，流動室充滿鞘液，在鞘液的約束下，細(xì)胞排列成單列由流動室的噴嘴噴出，成為細(xì)胞液柱。

3、液柱與水平方向的入射激光束垂直相交，相交點稱為測量區(qū)。通過測量區(qū)的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。這些信號分別被成90℃角方向放置的光電倍增熒光檢測器和前向角放置的光電二極管檢測器接收，經(jīng)過轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電子信號。

4、電子信號經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換輸入計算機。計算機通過相應(yīng)的軟件儲存、計算、分析，就可以得到細(xì)胞的大小和活性、核酸含量等理化指標(biāo)。

細(xì)胞分選原理

在壓電晶體上加上頻率為30kHz的信號，使之產(chǎn)生同頻率的機械振動，流動室也隨之振動，這樣通過測量區(qū)的液柱斷裂成一連串均勻的液滴。

在細(xì)胞形成液滴以前，各類細(xì)胞的特性已在測量區(qū)被測定并儲存。如果其特性與要分選的細(xì)胞相同時，儀器就在這類細(xì)胞形成液滴時給該液滴充與指定的電荷，這樣，當(dāng)被選定的細(xì)胞形成液滴時就帶有特定的電荷，未被選定的細(xì)胞形成的細(xì)胞液滴及不含細(xì)胞的空白液滴不被充電，也就不帶電荷。

帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時，依據(jù)所帶電荷符號向左或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)，不帶電荷的液滴不發(fā)生偏轉(zhuǎn)，垂直落入廢液槽中排出，從而實現(xiàn)細(xì)胞的分類。

熒光染色原理

免疫熒光染色：細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)的抗原分子與相應(yīng)的熒光素標(biāo)記McAb作用一定時間后形成帶有熒光素的抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出特定的熒光，其熒光強度與被測定抗原分子含量呈比例關(guān)系，由此可求得被測細(xì)胞與標(biāo)記McAb相對應(yīng)抗原的表達(dá)量和陽性細(xì)胞百分比。

常用的熒光染料有異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）、別藻青蛋白（APC）和Perdinin葉綠素（PerCP）等，經(jīng)488nm激光激發(fā)后其發(fā)射熒光光譜有差別，因而可將其用于標(biāo)記不同的McAb進(jìn)行單色或多色免疫熒光染色。目前，流式細(xì)胞術(shù)有單色、雙色、三色、四色、五色熒光分析，對細(xì)胞的分析更加精密、深入。

免疫熒光染色常用方法：

直接免疫熒光法：用一種（單色）或者多種（多色）熒光素標(biāo)記的McAb染色細(xì)胞后測量其熒光強度和陽性細(xì)胞數(shù)。

間接免疫熒光法：用一種McAb與細(xì)胞作用后，洗去未結(jié)合McAb，再加入熒光素標(biāo)記的第二抗體（如羊抗鼠IgG-FITC），染色細(xì)胞后測量其熒光強度及陽性細(xì)胞數(shù)。

7.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)

流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)包括五部分：

（１）光源

（２）液流系統(tǒng)

（３）信號接收系統(tǒng)

（４）信號處理系統(tǒng)

（５）細(xì)胞分選器

以上整個系統(tǒng)由電子電路和計算機控制，用以收集、顯示、分析、儲存被測定的各種信號及控制細(xì)胞的分選收集。