上一期我們主要給大家科普了一下關(guān)于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一些背景知識（回顧請點(diǎn)我：【修飾專欄預(yù)告】打開研究新視角 ——蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM）），那么本期的內(nèi)容將圍繞著磷酸化修飾來展開！

首先，復(fù)習(xí)一下最簡單的概念：蛋白質(zhì)的磷酸化修飾（Phosphorylation modification），通常是指在酶的催化作用下，將ATP的磷酸根基團(tuán)，轉(zhuǎn)移到蛋白的氨基酸側(cè)鏈上，ATP隨之變?yōu)锳DP。該過程通常是可逆的，催化磷酸化修飾發(fā)生的酶，被稱為激酶（kinase），去除蛋白磷酸化修飾的酶，被稱為磷酸酶（phosphatase）。磷酸化修飾被稱為蛋白質(zhì)的功能“開關(guān)”，可以借此調(diào)控蛋白的活性。

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關(guān)于磷酸化發(fā)現(xiàn)的趣事

1883年，德國化學(xué)家Olof Hammarsten首次發(fā)現(xiàn)，作為乳汁中最主要的組成成分，酪蛋白（casein）除了含有五種已知的化學(xué)元素外（C, N, O, H and S），還有磷元素。這是人類歷史上第一次發(fā)現(xiàn)磷酸化蛋白的存在。

直到1954年，Eugene Kennedy發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟的勻漿物，能夠?qū)TP的磷酸轉(zhuǎn)移到酪蛋白上，其首次定義了激酶（“proteinphospho kinase”）。

遺憾的是，EugeneKennedy一直對自己的發(fā)現(xiàn)比較疑惑：為什么肝臟中的蛋白能夠?qū)⒛倘橹械牡鞍琢姿峄績烧咚坪鹾翢o關(guān)系啊。因此， Eugene Kennedy后來并未繼續(xù)開展磷酸化修飾相關(guān)的工作，轉(zhuǎn)而投向了脂質(zhì)的研究。多年以后，當(dāng)人們開始了解到磷酸化修飾如此重要的生物意義，并不斷取得重大進(jìn)展時(shí)，Eugene Kennedy遺憾地回憶到：“I dropped thestudy of protein kinases and, like the base Indian, cast a pearl away, elsericher than all his tribe!’”

1992年，F(xiàn)ischerand Krebs因?yàn)榻沂玖姿峄揎検侵饕纳镎{(diào)控機(jī)制，而分享了當(dāng)年的諾貝爾獎。

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磷酸化修飾——無處不在

磷酸化修飾是目前已知分布最為廣泛的翻譯后修飾。據(jù)估計(jì)，真核生物中有將近1/3的蛋白，能夠在任何時(shí)候被磷酸化。

目前，人類細(xì)胞中已證實(shí)的激酶有518種，而植物擬南芥與水稻中被預(yù)測分別有1000種和1467種激酶。（雖然目前人類樣本中的磷酸化研究的成果最為豐富，但是從激酶數(shù)量上來看，植物樣本的磷酸化功能可能更為復(fù)雜多樣，好比未被開墾的處女地。）

磷酸化蛋白和位點(diǎn)的數(shù)據(jù)，據(jù)預(yù)測有1-2 million個(gè)。在實(shí)際的研究中，借助于質(zhì)譜技術(shù)，哺乳動物的磷酸化修飾數(shù)據(jù)量的鑒定記錄，為62,679phosphosites on 11,632proteins，來自于《Nature》上刊登的一篇乳腺癌組織的磷酸化蛋白質(zhì)組分析。植物中最多的磷酸化數(shù)量的報(bào)道，為60,366phosphosites on 8141 proteins，來自于多個(gè)研究的數(shù)據(jù)整理。從這些實(shí)際檢測到的數(shù)據(jù)來看，磷酸化修飾的數(shù)量遠(yuǎn)超我們的預(yù)知。

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磷酸化修飾——無所不能

在生物領(lǐng)域，大自然反復(fù)強(qiáng)調(diào)的一個(gè)真理是：存在即有功能，更何況磷酸化修飾是如此豐富的存在。磷酸化修飾，可以說是無所不能。難怪Dr Dewi Brennig James曾在1997年的一篇《Nature》發(fā)文中，感嘆到：'The chemistry of Phosphorus is the chemistry of life, sorry Carbon'。

我們通過大量的文獻(xiàn)調(diào)研，對目前所知的磷酸化修飾對生物過程的調(diào)控作用，做了一個(gè)概括，大致可歸類為以下幾個(gè)方面：

1.調(diào)控細(xì)胞膜功能：

主要是指磷酸化調(diào)控細(xì)胞膜上各種蛋白的功能，主要有兩種方式：

（1）目標(biāo)蛋白發(fā)生磷酸化修飾，直接改變蛋白活性。受調(diào)控的膜蛋白主要包括：受體（如細(xì)胞因子受體、植物激素受體、神經(jīng)遞質(zhì)受體、植物RLKs等）、離子通道（如Potassium channels、Calcium channels）、轉(zhuǎn)運(yùn)體（如神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體SERT與DAT、植物PIN‐FORMED(PIN) auxin efflux carriers）、水通道（Aquaporin）、細(xì)胞連接通道（Connexins），等等。

IUBMB Life. 2015 Jul;67(7):524-32.

（2）調(diào)控這些膜蛋白的內(nèi)吞過程。蛋白被磷酸化修飾后，會觸發(fā)其被內(nèi)吞，那么在膜上發(fā)揮功能的蛋白的含量就減少了，從而間接調(diào)控膜蛋白功能。

Journalof Integrative Plant Biology 2013, 55 (9): 789–808

2. 調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：

這是磷酸化修飾最為熟知的功能，內(nèi)容非常繁雜，概括起來主要包括，但不限于：

※ 營養(yǎng)和代謝感知信號：包括細(xì)胞所需的氨基酸、糖等營養(yǎng)物質(zhì)的監(jiān)視和代償處理的信號機(jī)制，以維持細(xì)胞功能所需的營養(yǎng)供應(yīng)和代謝平衡維持：

Trends EndocrinolMetab. 2015 Dec;26(12):676-87

※ 免疫模式識別受體信號（pattern-recognition receptors (PRRs）：動物和植物的免疫系統(tǒng)對“異物”的識別后，磷酸化修飾負(fù)責(zé)后續(xù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引發(fā)對“異物”的處置，如TLR受體家族信號通路：

Immunity. 2016 Jul 19;45(1):15-30

※ 細(xì)胞因子受體信號：細(xì)胞因子是細(xì)胞外信息傳遞、細(xì)胞間交流和細(xì)胞自我調(diào)控的主要物質(zhì)，可廣泛參與各種細(xì)胞行為的調(diào)控。主要包括生長因子、趨化因子、白介素家族等。很多受體的胞內(nèi)域本身具有激酶活性，或能夠招募激酶。胞外的細(xì)胞因子與受體的胞外域結(jié)合后，會引起受體胞內(nèi)域的磷酸化修飾，進(jìn)而通過一系列的磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引發(fā)蛋白轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長、遷移、死亡等多種行為的應(yīng)答。以生長因子類信號通路為例：

※ 植物激素信號：包括ABA, cytokinin, BR, auxin, gibberellicacid, jasmonic acid, kinetin等激素，在細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)均可由相應(yīng)的激酶介導(dǎo)。因此，磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是調(diào)控植物生理、脅迫應(yīng)激的關(guān)鍵過程。以ABA與cytokin信號通路為例：

Enzymes.2014;35:27-56； Nature Chemical Biology 5,301–307 (2009)

※ 干細(xì)胞增殖與分化信號：比如大家檢測Wnt/?-catenin, Notch, Hedgehog等干細(xì)胞增殖、分化相關(guān)通路的活性時(shí)，一般都是檢測這些蛋白的磷酸化水平的表達(dá)變化。以Wnt/?-catenin通路為例：

※ 神經(jīng)活動相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：如神經(jīng)遞質(zhì)受體NMDA receptor、AChR，以及ion chanel與transpoters，這些蛋白的下游往往會通過第二信使如Ca2+、cAMP引發(fā)激酶的激活。另外，神經(jīng)營養(yǎng)因子受體NT receptor也是通過磷酸化修飾進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，過程參考細(xì)胞因子信號。因此，磷酸化在神經(jīng)生理方面發(fā)揮重要作用。

Neural Regen Res. 2013 Mar25;8(9):843-52.

※ 生物節(jié)律信號：2017年諾貝爾獎成果也與磷酸化修飾密切相關(guān)，例如哺乳動物晝夜節(jié)律的關(guān)鍵調(diào)控者之一就是casein kinase I (CKIε)：

NatRev Mol Cell Biol. 2007 Feb;8(2):139-48.

※ 應(yīng)激相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：生物細(xì)胞內(nèi)具有一整套機(jī)制來監(jiān)視內(nèi)外環(huán)境的變化，以便迅速做出反應(yīng)，因此磷酸化修飾成為一種重要的調(diào)控機(jī)制。磷酸化修飾參與oxidative stress 、DNA damage、temperature與osmotic stress等各種應(yīng)激反應(yīng)。細(xì)胞通過相關(guān)機(jī)制感知到應(yīng)激情況后，會通過激酶將信號專遞出去，引起效應(yīng)蛋白的功能改變，繼而迅速應(yīng)對環(huán)境的變化。以DNA損傷應(yīng)激、溫度脅迫與氧化應(yīng)激的響應(yīng)通路為例：

Cell Cycle. 2010 Sep1;9(17):3479-84.； TrendsPlant Sci. 2007 Oct;12(10):444-51. ；Int J Mol Sci. 2015Oct 23;16(10):25234-63.

3. 轉(zhuǎn)錄調(diào)控：

轉(zhuǎn)錄過程的啟動，最經(jīng)典的過程就是：胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子激活，然后進(jìn)入細(xì)胞核，在各種轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白的幫助下，轉(zhuǎn)錄因子與DNA啟動子結(jié)合，最后與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物蛋白一起啟動轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯過程。實(shí)際上，上述的整個(gè)過程目前發(fā)現(xiàn)都與磷酸化修飾的調(diào)控有關(guān)（因此，磷酸化修飾變化往往先于蛋白表達(dá)變化，這就是為什么磷酸化修飾通常取樣的處理時(shí)間比較早），具體過程大致如下：

※ 第一步：磷酸化修飾可通過直接或間接的方式，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的活化，使其轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核：

（1）直接激活轉(zhuǎn)錄因子：轉(zhuǎn)錄因子往往處于信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游，是很多信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的終點(diǎn)之一。很多轉(zhuǎn)錄因子可通過磷酸化修飾形式而轉(zhuǎn)為激活狀態(tài)，然后進(jìn)入細(xì)胞核與DNA約會（如STAT等）。

（2）修飾轉(zhuǎn)錄因子和/或轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)蛋白，從而招募或抑制兩者的相互作用。例如，NF-kB在非激活狀態(tài)下處于被kIB抑制的狀態(tài)，磷酸化可通過改變kIB的抑制作用，而間接釋放轉(zhuǎn)錄因子活性。相反CREB與CREB-binding protein (CBP)結(jié)合則是直接通過磷酸化修飾介導(dǎo)的。

（3）調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子降解：很多轉(zhuǎn)錄因子的特定位點(diǎn)被磷酸化修飾后，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子被泛素連接酶所識別，進(jìn)而通過泛素化降解機(jī)制來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性的抑制。如大名鼎鼎的p53 tumor suppressor就是通過磷酸化進(jìn)行激活和降解雙向調(diào)控。這也是，磷酸化稀釋與泛素化修飾主要的cross-talk形式。

※ 第二步：轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核后，磷酸化修飾通過調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，為轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與DNA結(jié)合提供條件：

（1）磷酸化修飾可調(diào)控SWI/SNFremodeling complex活性，進(jìn)而調(diào)控核小體的重構(gòu)

（2）磷酸化可直接修飾組蛋白，進(jìn)而參與組蛋白對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。已知的組蛋白磷酸化修飾位點(diǎn)以及功能，如下：

Cold SpringHarb Symp Quant Biol. 2010;75:23-6.

（3）磷酸化調(diào)控組蛋白甲基化酶、去甲基化酶和相關(guān)效應(yīng)蛋白的活性，間接調(diào)控基因信息的“讀寫”和“擦除”。通過這種方式，磷酸化修飾參與基因表觀調(diào)控。已知的表觀相關(guān)蛋白的磷酸化修飾如下：

Prog BiophysMol Biol. 2015 Jul;118(1-2):8-13.

※ 第三步：磷酸化修飾調(diào)控轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與DNA啟動子的結(jié)合，啟動DNA轉(zhuǎn)錄過程：

（1）轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化修飾后，會影響轉(zhuǎn)錄因子的電荷性質(zhì)變化，從而影響其與DNA的直接結(jié)合能力。

（2）磷酸化修飾可調(diào)控基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的活性：如磷酸化可修飾RNA polymerase II， general tranionfactors (GEFs)等，使相關(guān)蛋白協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用

4. 磷酸化調(diào)控線粒體功能與能量代謝：

※ 磷酸化調(diào)控線粒體功能：很多研究已經(jīng)證實(shí)，線粒體中存在多種激酶如PKA、Akt、MAPK、Abl、SRC等。通過這些激酶，線粒體的多種生物過程都存在磷酸化修飾的參與：

（1）參與線粒體DNA維持、轉(zhuǎn)錄和翻譯（TFAM、CREB、ComplexI-V的磷酸化修飾）

（2）調(diào)控TCA循環(huán)（Aconitase hydratase、Citrate synthase的磷酸化修飾）

（3）調(diào)控Carbohydratemetabolism（Glycerol-3-phosphate dehydrogenase、Hexokinases 1 & 2、PDH的磷酸化修飾）

（3）參與氨基酸代謝（branchedchain dehydrogenase (BCDH) 的磷酸化修飾）

（4）調(diào)控Mitochondrialdynamics（Drp1、Miro、Parkin的磷酸化修飾）

（5）調(diào)控線粒體相關(guān)凋亡（BAD、BCL-xL、MPTP的磷酸化修飾）

（6）調(diào)控自噬（Parkin的磷酸化修飾）

Experimental Gerontology 56 (2014) 202–220

※ 磷酸化修飾調(diào)控代謝過程：生物酶是代謝過程的掌控者。而磷酸化修飾是代謝酶活性調(diào)控的重要開關(guān)之一（另一個(gè)主要開關(guān)是酰化修飾）。大多數(shù)胞漿及線粒體內(nèi)的代謝酶均具磷酸化修飾。以葡萄糖代謝途徑為例，每個(gè)代謝流程上負(fù)責(zé)的代謝酶幾乎都具有磷酸化修飾的形式：

Oncogene (2014) 33, 4279–4285

5. 磷酸化修飾調(diào)控細(xì)胞骨架：

細(xì)胞骨架是細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)單元，不僅決定著細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞器的有序分布，還是細(xì)胞移動、增殖分裂、物質(zhì)運(yùn)輸、分泌、神經(jīng)軸突生長等過程的主要參與者。磷酸化修飾對細(xì)胞骨架的調(diào)控主要體現(xiàn)在：

※ 細(xì)胞骨架調(diào)控相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，為磷酸化形式，包括：CDC42/Rac/PAK, Rho/ROCK,FAK, LIMK, CaMK, Cortactin, WASP等。一般大家研究細(xì)胞骨架調(diào)控的信號變化，檢測的都是這些蛋白的磷酸化水平。

※ 磷酸化修飾可調(diào)控細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白的活性，影響其對細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)：如cofilin, VASP, Arp2/3等

※ 磷酸化修飾直接調(diào)控細(xì)胞骨架蛋白以及粘附斑蛋白的基本結(jié)構(gòu)單元：如actin、tubulin 、myosin、vimentin、Paxillin、vinculin等的磷酸化，最終影響微絲、微管等的聚合、解聚和結(jié)構(gòu)等。

6. 單細(xì)胞生物：

※ 對于單核細(xì)胞而言，翻譯后修飾更為重要。因?yàn)檫@些細(xì)胞直接暴露于環(huán)境中，通過翻譯后修飾這種快速響應(yīng)的機(jī)制，能夠保證其對環(huán)境變化做出快速反應(yīng)。因此，單細(xì)胞生物常常利用磷酸化修飾來不斷調(diào)整其代謝策略，保證其對環(huán)境的適應(yīng)能力。

※ 此外，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化對于病原微生物對宿主的感染能力至關(guān)重要。很多證據(jù)表明，具有致病性的病原菌比非致病性的致病菌擁有更多的酪氨酸磷酸化修飾。相關(guān)的機(jī)制包括：磷酸化修飾調(diào)控細(xì)菌表面多糖的合成，調(diào)控真菌菌絲、莢膜生長等，調(diào)控病原微生物的增殖、成熟、侵入和對宿主免疫系統(tǒng)的影響，等等。

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總結(jié)

磷酸化修飾可以廣泛調(diào)控細(xì)胞的生物功能，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄翻譯、代謝等生物過程。上述的內(nèi)容，只是我們?yōu)榇蠹铱偨Y(jié)的磷酸化修飾功能的一隅。幾乎可以說，只要是蛋白質(zhì)參與的生物過程，都有磷酸化修飾的參與（換句話說，同樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或生物表型，除了研究蛋白質(zhì)表達(dá)以外，完全可以從磷酸化修飾的角度進(jìn)行切入研究）。因此，磷酸化已經(jīng)逐漸成為各個(gè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，如動、植物的生長發(fā)育，腫瘤、心血管等各類疾病，生物免疫、神經(jīng)系統(tǒng)功能、植物脅迫，等等。雖然，目前對磷酸化修飾的作用，已經(jīng)有了整體的概念。但是，對于某個(gè)具體生物過程中，有哪些蛋白通過磷酸化修飾形式參與？某個(gè)具體的蛋白是如何發(fā)生磷酸化修飾的？磷酸化修飾具體發(fā)揮了怎樣的功能作用？目前學(xué)術(shù)界了解的還是及其有限的，值得大家開展廣泛的探索和深入研究。

最后本期的內(nèi)容以本文中提到的兩句名言結(jié)尾（經(jīng)過本期的介紹，也許大家對著兩句名言有了更深入的理解）：