Alan Dove /文

你是伐木的還是劈柴的？幾個世紀(jì)以來，生物學(xué)家一直在思考這個基本的認(rèn)識論二分法問題：他們是應(yīng)該對廣闊的生命領(lǐng)域進(jìn)行全面的研究，還是走還原主義的道路，將其分解成最基本的組成部分？

分子生物學(xué)家們長期以來以還原主義者自居，但是卻始終有一個令人沮喪的制約條件。當(dāng)他們以驚人的速度和精準(zhǔn)度對DNA和RNA進(jìn)行測序時，他們的數(shù)據(jù)所展現(xiàn)的是整個細(xì)胞群體的混合信息，而非單個的基因組。無論是一個組織切片，一個腫瘤活檢樣品，還是一個細(xì)菌培養(yǎng)樣品中所得到的測序數(shù)據(jù)展現(xiàn)的都是樣品中所有細(xì)胞基因組的平均信息，雖然研究人員知道每個樣品中細(xì)胞與細(xì)胞之間都可能有著驚人的多樣性。

在過去的幾年里，研究人員和設(shè)備商終于開始打破這個技術(shù)瓶頸，開發(fā)出一系列新的工具和技術(shù)用于單細(xì)胞測序。單細(xì)胞RNA測序現(xiàn)在能夠完整地繪制單個樣品中的轉(zhuǎn)錄活性譜圖，而單細(xì)胞DNA測序數(shù)據(jù)可以揭示那些從前看起來一樣的細(xì)胞之間基因組中的微小差異。新的結(jié)果是令人振奮的，但是有些技術(shù)，尤其是DNA測序，也對新手隱藏了一些陷阱。

在兩種技術(shù)中，單細(xì)胞RNA測序得到了更多的支持。有些公司在出售相關(guān)的試劑盒設(shè)備，用來從單細(xì)胞中分離RNA，同時可以獨(dú)立保存數(shù)以千計的樣品。還有些公司將這些技術(shù)作為一種服務(wù)來提供，他們拿走客戶裝有細(xì)胞的樣品管，再送回完整的單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)。計劃進(jìn)行大量單細(xì)胞RNA分析的研究人員甚至可以購買完整的系統(tǒng)。

“任何人都可以購買我們的系統(tǒng)，我們就是打算把它做成一個高度分布式，易于使用的平臺?！蔽挥诩又萜杖R森頓的10X Genomics公司的首席科學(xué)官和共同創(chuàng)始人Ben Hindson解釋說。10x系統(tǒng)使用微流控芯片將細(xì)胞樣本分割成數(shù)十萬個微小液滴。然后這些液滴與凝膠珠混合，每個凝膠珠都帶有獨(dú)特的寡核苷酸“條形碼”。10x的專有條形碼合成和混合系統(tǒng)確保幾乎每個細(xì)胞都有一個對應(yīng)的條形碼珠。然后，使用標(biāo)準(zhǔn)的RNA測序技術(shù)就可以產(chǎn)生數(shù)百萬個短序列，包括細(xì)胞RNA和條形碼。通過將RNA序列與條形碼連接，系統(tǒng)的開源軟件可以為每個細(xì)胞重建RNA序列池。

整理這么多數(shù)據(jù)顯然需要復(fù)雜的計算，但Hindson表示，他們公司非常重視保持系統(tǒng)的用戶友好性?！拔覀兊哪繕?biāo)是把萬能鑰匙型解決方案交給那些生物信息學(xué)功底不太深厚的用戶，”他還補(bǔ)充道，“這使得系統(tǒng)的受眾更加廣泛”。10x的軟件不僅包括解碼單細(xì)胞數(shù)據(jù)所需的基本功能，還包括一套用于分析和可視化的工具。因?yàn)?0x軟件是開源的，經(jīng)驗(yàn)豐富的用戶可以對其進(jìn)行修改，甚至將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出到自己的程序中。

然而，在購買單細(xì)胞RNA系統(tǒng)或?qū)颖舅徒o外包服務(wù)公司之前，研究人員應(yīng)該仔細(xì)考慮他們的需求。他們應(yīng)該問問自己：“你在分析什么類型的樣品，你需要達(dá)到什么樣的靈敏度，從這些細(xì)胞中你想要獲得什么樣的信息？”Hindson解釋說。專精于這些技術(shù)的公司樂于和潛在客戶討論這些問題。Hindson補(bǔ)充道，那些看起來簡單的問題，比如測序之前細(xì)胞如何分離和保存，都可能對數(shù)據(jù)的質(zhì)量造成巨大的影響。

小心細(xì)致的樣品處理是許多單細(xì)胞分離策略的基本要求，這一類型的方法近年來呈指數(shù)增長。分析DNA比RNA更需要選擇好的單細(xì)胞分離方法，這一點(diǎn)尤為重要。

“有很多選項(xiàng)，但是每一個選項(xiàng)都有它的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。對于研究人員來說，根據(jù)他們的具體應(yīng)用來選擇合適的分離方法，這很重要。”德國希爾登的Qiagen公司的生命科學(xué)部高級市場經(jīng)理Mary Langsdorff說。

對于那些知道目標(biāo)細(xì)胞是什么樣子的研究人員來說，最好是手工挑選。為了盡量溫和地做到這一點(diǎn)，Qiagen公司的QIAscout細(xì)胞分離系統(tǒng)將細(xì)胞分散在一個有磁性的膜片微陣列上。從而，研究人員只需使用一臺普通的倒置顯微鏡就可以將所需的細(xì)胞取出，并將其轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的樣品管或微滴孔中。

一旦完成細(xì)胞分離，下一步就是選擇一種分析策略。對于DNA測序，首先需要擴(kuò)增每個細(xì)胞的基因組，以便構(gòu)建測序庫。雖然聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）仍然是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)DNA擴(kuò)增技術(shù)，即使是高保真的PCR技術(shù)在從單個基因組為模板進(jìn)行復(fù)制時也會引入數(shù)以百萬計的錯誤。這就是為什么大多數(shù)單細(xì)胞DNA測序現(xiàn)在依賴于多重置換擴(kuò)增（MDA）的原因。

MDA在恒定溫度下工作，不需要有序列特異性的引物，并且很少引入錯誤。“多重置換技術(shù)使用的酶具有很高的流變性，也是一種非常高保真的酶。所以我們可以在這個過程中保證基因組得到一致的覆蓋率……和非常高的序列復(fù)制準(zhǔn)確性。”Langsdorff說。

DNA擴(kuò)增結(jié)束后，研究人員就可以進(jìn)行建庫和測序了。即使基因組測序的價格下降到每個人類基因組1000美元以下，但對數(shù)十或數(shù)百個單個細(xì)胞的基因組測序顯然也很昂貴，這凸顯了事先仔細(xì)選擇和處理細(xì)胞的重要性。盡管如此，在嘗試識別變異之前對多個細(xì)胞進(jìn)行測序仍至關(guān)重要。那是因?yàn)閱渭?xì)胞DNA測序的深度通常很淺，一般只有1倍或更少?！叭缓竽阈枰獙Ρ纫幌隆阋呀?jīng)建立的所有測序庫。只有當(dāng)一種突變同時出現(xiàn)在多個庫中時，你才能將其稱為突變。” Langsdorff解釋道。

盡管與單細(xì)胞RNA研究相比，單細(xì)胞DNA測序仍面臨挑戰(zhàn)。但顯然，它越來越受歡迎了。研究人員已經(jīng)在使用單細(xì)胞分析技術(shù)來識別腫瘤和組織內(nèi)的基因突變，Langsdorff說這項(xiàng)技術(shù)也很快在微生物學(xué)領(lǐng)域站穩(wěn)腳跟。

使用者需要比較多個細(xì)胞的DNA序列來鑒別真性遺傳突變和人為誤差，這限制了單細(xì)胞測序的應(yīng)用潛力。對于想要識別單核苷酸突變的研究人員來說，這是一個特別嚴(yán)重的問題。最近的報道指出，傳統(tǒng)的細(xì)胞分離和基因組擴(kuò)增策略，即使是MDA，也會在人類基因組中引入多達(dá)上百萬的假陽性單核苷酸突變，超過了真正的陽性突變（1）。

這些差錯大部分源于研究人員習(xí)慣使用的細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)流程?！爱?dāng)你進(jìn)行細(xì)胞裂解和DNA變性時，會引入一種叫做脫氨胞嘧啶的人為突變，這是由過程中的加熱步驟造成的?！奔又萸鹄S斯塔的Novogene公司的全球市場總監(jiān)Joyce Peng解釋說。但最近紐約的SingulOmics公司的研究人員開發(fā)了一種新的技術(shù)，可以避免對細(xì)胞和DNA進(jìn)行加熱。將該方法與高保真MDA擴(kuò)增相結(jié)合，可以將假陽性率降低兩個數(shù)量級。

SingulOmics和Novogene正在合作，他們把完整的單細(xì)胞基因組工作流程作為一項(xiàng)服務(wù)。研究人員可以將他們的細(xì)胞送到SingulOmics進(jìn)行樣品制備和基因組擴(kuò)增，然后再將擴(kuò)增后的DNA送到Novogene進(jìn)行測序。一旦測序完成，SingulOmics還可以提供數(shù)據(jù)分析服務(wù)。過程的兩個部分也可以單獨(dú)進(jìn)行。傾向自己進(jìn)行測序和分析的研究人員可以在這個過程中略過Novogene，而單純地獲取來自SingulOmics擴(kuò)增的DNA。而那些能夠輕松分離細(xì)胞，只需要測序的客戶，就可以直接去Novogene公司?！坝袃深惪蛻?。一類是按照我們的講解，自己分離細(xì)胞；另一類是由我們分離細(xì)胞，所以他們只需要提供一個細(xì)胞懸浮液?！眮碜訬ovogene的Peng介紹。

雇傭外包公司來處理整個過程對單細(xì)胞測序新手來說尤其有效。因?yàn)榉?wù)提供商“為了完善這些技術(shù)，犯過很多錯誤，花過很多錢，”Peng強(qiáng)調(diào)，研究人員應(yīng)該“為了節(jié)約時間而雇傭服務(wù)提供商”。

單細(xì)胞DNA工作的新手為了適應(yīng)復(fù)雜和不斷發(fā)展的擴(kuò)增技術(shù)，可能也需要幫助。“有很多全基因組擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)流程，但有些研究人員不太清楚哪種流程對他們的研究最有利?！瘪R薩諸塞州坎布里奇的BGI的領(lǐng)域應(yīng)用專家Zonghui Peng介紹。

雖然MDA已成為鑒定單核苷酸突變類項(xiàng)目的首選擴(kuò)增方法，但尋找基因拷貝數(shù)突變的實(shí)驗(yàn)室通常更熱衷于一種稱為“多退火和環(huán)基擴(kuò)增循環(huán)”（MALBAC）的方法。與PCR一樣，MDA允許基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物作為進(jìn)一步擴(kuò)增的模板；但MALBAC只擴(kuò)增原始基因組的DNA。這使MALBAC成為精確計算每個細(xì)胞中基因拷貝數(shù)的理想方法?；蚪M擴(kuò)增方法的多樣性凸顯了一個必要步驟的重要性，那就是在開始單細(xì)胞測序?qū)嶒?yàn)之前，研究人員應(yīng)該有一個明確的科學(xué)問題。

需要仔細(xì)規(guī)劃實(shí)驗(yàn)的另一個原因是成本?！叭蚪M、單細(xì)胞測序的成本與大量細(xì)胞測序的成本大致相同?！盉GI的Peng解釋。由于研究人員不可避免地需要對樣本中的數(shù)十或數(shù)百個細(xì)胞進(jìn)行測序，錯誤或設(shè)計不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)可能很快就會吞噬掉大量經(jīng)費(fèi)。

與SingulOmics和Novogene一樣，BGI也提供一系列單細(xì)胞基因組學(xué)服務(wù)?！癇GI能夠處理已經(jīng)分離的單個細(xì)胞和大批量細(xì)胞這兩種類型的樣品?！盳onghui Peng介紹。客戶還可以讓BGI提供各種類型的對照樣本，并選擇他們想要的數(shù)據(jù)類型。“如果我們的客戶自己有能力做生物信息學(xué)分析，他們通常會要原始數(shù)據(jù)，否則我們會建議BGI來完成生物信息學(xué)分析?！彼a(bǔ)充道。

與業(yè)內(nèi)其他人一樣，BGI的Peng也強(qiáng)調(diào)了從一開始就認(rèn)真處理樣品十分重要。他還建議對部分樣本進(jìn)行普通的大量細(xì)胞測序，以便與單細(xì)胞DNA數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

BGI和Novogene也都提供單細(xì)胞RNA測序服務(wù)。

隨著設(shè)備制造商和服務(wù)提供商試圖讓更多實(shí)驗(yàn)室能夠接觸到單細(xì)胞測序技術(shù)，這個領(lǐng)域里最前沿的研究人員正為這項(xiàng)技術(shù)開拓一片全新的疆土。對于單細(xì)胞DNA測序來說尤其如此，這個工具的潛在用戶剛剛開始探索。

雖然新技術(shù)提高了研究人員分離和擴(kuò)增單個基因組的能力，但另一個重大問題隨之逼近，它映射出了人們耳熟能詳?shù)恼w論和還原論之間的矛盾關(guān)系?！皻w根結(jié)底，我們談?wù)摰氖巧锵到y(tǒng)——我們對單獨(dú)的一個細(xì)胞并不感興趣，我們感興趣的是如何通過分析許多個單細(xì)胞來幫助我們更好地理解整個系統(tǒng)。”加州大學(xué)舊金山分校藥學(xué)院的生物工程專業(yè)副教授Adam Abate說。例如，即使是對一個小腫瘤，要構(gòu)建一個完整的基因突變圖譜，也需要對數(shù)萬億個單細(xì)胞進(jìn)行測序?！艾F(xiàn)在這根本不可能?！彼硎?。

然而，這也許很快就會成為可能。在最近的一項(xiàng)概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，Abate和他的同事對海水樣本進(jìn)行了單細(xì)胞基因組測序?！拔覀兿Ｍ诓贿M(jìn)行任何培養(yǎng)的情況下，盡可能地獲取樣本中每個細(xì)胞的全基因組序列?！盇bate說。通過這個項(xiàng)目，他們開發(fā)了一套高通量測序?qū)嶒?yàn)流程。只需單次運(yùn)行，就可以檢測到超過50,000個微生物細(xì)胞的部分基因組（2）。

這項(xiàng)技術(shù)在很大程度上依賴于定制化的微流控芯片。這種器件可以將細(xì)胞分離到單個的凝膠液滴內(nèi)，它使得研究人員在分離細(xì)胞的同時，裂解細(xì)胞并對其DNA進(jìn)行擴(kuò)增。隨后，這些液滴與另一組含有寡核苷酸條形碼的液滴合并。盡管這些條形碼與10X Genomics公司的RNA測序條形碼合成方式不同，但它們的作用是相似的。條形碼將對每個細(xì)胞基因組擴(kuò)增得到的片段與一個獨(dú)特的識別序列聯(lián)系起來。最后，研究團(tuán)隊(duì)對帶條形碼標(biāo)記的基因組進(jìn)行測序并分析數(shù)據(jù)。

盡管這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果允許Abate的實(shí)驗(yàn)室區(qū)分單個微生物物種，鑒定抗生素抗性基因，并發(fā)現(xiàn)毒性因子，但他認(rèn)為還有很大的改進(jìn)空間?！霸诿總€基因組里，我們平均只能得到1%的覆蓋率，而且統(tǒng)計分布差異非常大。很多細(xì)胞的覆蓋率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過1%，還有很多細(xì)胞的覆蓋率卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不到1%?！彼忉尩?。Abate的研究團(tuán)隊(duì)正在努力改進(jìn)這些統(tǒng)計方法，他位于加州南舊金山的公司Mission Bio，正在開發(fā)微流控芯片的商業(yè)化版本，以便讓其他研究人員能夠使用這項(xiàng)技術(shù)。

隨著成本的降低和方法的標(biāo)準(zhǔn)化，該領(lǐng)域的專家期待單細(xì)胞測序?qū)⒊蔀檗D(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)研究的新模式。研究人員不再需要在大塊樣品的整體分析和單個成分的簡化分析之間做出艱難抉擇，而是能夠把這兩種方法結(jié)合起來，得到整個生物系統(tǒng)的綜合圖譜?！斑@是一項(xiàng)真正具有變革性的技術(shù)，它產(chǎn)生的影響在之前是絕對無法想象的，” Abate評價說。

引用文獻(xiàn)：

1. X. Dong, et al., Nat. Methods14, 491-493(2017), doi: 10.1038/nmeth.4227.

2. F. Lan, et al., Nat. Biotechnol.35,640-646 (2017), doi: 10.1038/nbt.3880.

作者Alan Dove是常駐馬薩諸塞州的科學(xué)作家和編輯。

致謝：本文中文翻譯內(nèi)容來自《科學(xué)新聞》，譯者李楠是中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院的副研究員。