從現(xiàn)在開始解讀2018年4月的TCGA終結(jié)系列文章，因為涉及到的代碼知識不多，我就不親自出手了，會邀請我的幾個學生來一一解讀，當然，也歡迎廣大粉絲投稿，運氣的話有機會得到我的關(guān)注和指導。

免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及治療耐受過程中占據(jù)重要位置，預示著我們可以從免疫微環(huán)境參與腫瘤治療耐受的這一視角出發(fā)，為尋找新的抗腫瘤途徑開辟新的思路，下面我們就一起來嘗試了解這篇癌癥免疫圖譜文章吧。

2018年4月Immunity雜志上發(fā)表了文章The Immune Landscape of Cancer ，由34個單位共同合作完成。文章對TCGA中33種癌癥，超過10,000個腫瘤樣本進行了免疫原性分析，將所有腫瘤分成6種免疫亞型，即：

wound healing, IFN-γ dominant, inflammatory, lymphocyte depleted, immunologically quiet, and TGF-β dominant

進一步分析：

• 不同亞型間巨噬細胞或淋巴細胞特征、Th1:Th2細胞比例、腫瘤異質(zhì)性程度、非整倍性、新抗原負荷程度、細胞增殖、免疫調(diào)節(jié)基因的表達、預后等指標的差異。

• 與免疫相關(guān)的驅(qū)動突變

• 參與腫瘤免疫的細胞內(nèi)和細胞間調(diào)控網(wǎng)絡（調(diào)控網(wǎng)絡包含轉(zhuǎn)錄、microRNA、拷貝數(shù)、表觀遺傳信息）

分析流程

step1. 下載TCGA平臺33種癌癥類型的6種分子平臺數(shù)據(jù)（mRNA、microRNA、外顯子測序數(shù)據(jù)；甲基化、拷貝數(shù)、蛋白質(zhì)芯片數(shù)據(jù)）

step2. 為全部非血液類癌癥進行免疫表達特征（160種）評分，將TCGA全部腫瘤聚類成6種免疫亞型

step3. 根據(jù)DNA甲基化、mRNA和H&E圖像分析確定白細胞類型及比例（用于評估免疫浸潤細胞的組成）

step4. 生存分析評估免疫亞型與預后的關(guān)系

step5. 分別以TCGA腫瘤類型、TCGA定義的分子亞型、6種免疫亞型分組，比較新抗原、病毒RNA表達、T細胞受體(TCR)和B細胞受體(BCR)、免疫調(diào)節(jié)因子(IM)表達與調(diào)控等特征（評估影響免疫原性和免疫浸潤的因素間的關(guān)系）

免疫原性（immunogenicity)：能引起機體產(chǎn)生免疫應答的物質(zhì)

腫瘤浸潤免疫細胞包括：T cells, B cells, natural killer cells, macrophages, neutrophils, dendritic cells, mast cells, eosinophils, basophils等

step6. 鑒定與免疫浸潤相關(guān)的體細胞變異（包括pathway, 拷貝數(shù)變異，driver mutation）

step7. 評估性別與祖源是否對特定腫瘤類型的免疫反應有影響

step8. 鑒定控制腫瘤免疫應答的細胞內(nèi)調(diào)控網(wǎng)絡、參與形成腫瘤免疫微環(huán)境(TME)的細胞外通訊網(wǎng)絡

癌癥的免疫亞型

計算160種免疫特征間的相關(guān)系數(shù)，聚類分析，得到5個核心模塊免疫表達特征（巨噬細胞 , 免疫浸潤淋巴細胞, TGF-β response , IFN-γ response, wound healing ) → 據(jù)此將TCGA中的非血液腫瘤聚成6種免疫亞型(C1-C6) → 6種免疫亞型中這5種免疫特征的分布情況。（圖1A）

6種免疫亞型中腫瘤樣本表現(xiàn)出的其它關(guān)鍵免疫特征（圖1B,C）

每種腫瘤類型中免疫亞型的組成情況，圖1D。

Figure 1. Immune Subtypes in Cancer

腫瘤免疫浸潤的組成

不同免疫亞型的主要免疫浸潤細胞分布，圖2A

白細胞比例(leukocyte fraction,LF)在不同免疫亞型間（圖1C）和不同腫瘤類型間（圖2B）存在差異。

腫瘤基質(zhì)比例與白細胞比例的相關(guān)性在腫瘤類型中不同，圖2C顯示2種代表性的腫瘤。（該相關(guān)性在免疫亞型的差別見補充圖2B）

基質(zhì)細胞：器官中的結(jié)締組織細胞，為器官中實質(zhì)細胞提供支持和營養(yǎng)。

已知基質(zhì)細胞和腫瘤細胞間的相互作用在腫瘤生長和進展中起主要作用?；|(zhì)細胞可以提供腫瘤細胞可以生長的細胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)細胞生長因子，還可能通過一氧化氮的產(chǎn)生限制T細胞增殖，從而阻礙免疫能力。

通過TCGA的H&E染色圖片分析估計出具有浸潤淋巴細胞的腫瘤區(qū)域的空間比例，按免疫亞型查看，發(fā)現(xiàn)C2亞型的淋巴細胞浸潤區(qū)比例最高，圖2D。

Figure 2. Composition of the Tumor Immune Infiltrate

腫瘤免疫反應與預后

6種免疫亞型OS生存分析（圖3A）：C3預后最佳；C1,C2雖然免疫成分多，但預后并不好；C4,C6免疫特征混雜，預后最差。（PFI結(jié)果見補充圖3A）

計算5種免疫表達特征分數(shù)與OS的一致性指數(shù)，紅色代表高風險。按免疫亞型和腫瘤類型分組（圖3B），淋巴細胞特征與C1,C2的預后改善相關(guān)；5種特征中任何一個增加都會導致C3預后更差。
計算輔助T細胞（Th1,Th2,Th17）與OS的一致性指數(shù)，按免疫亞型分組（圖3C），Th17細胞的增加與多數(shù)亞型的預后改善相關(guān)。

輔助T細胞（T helper cells, Th）,是一種T細胞（白細胞的一種），它的表面有抗原受體，可以識別抗原呈遞細胞的MHC-II 類分子呈獻的抗原片段。 輔助T細胞主要可區(qū)分為Th1 Th2 Th17 及 Thαβ等四種。

使用CoxPH建立免疫特征分數(shù)高低的生存模型，分數(shù)高低與生存顯著相關(guān)，圖3D是驗證集的KM-polt，圖3E顯示模型的預測準確度。圖3F說明添加腫瘤stage和tpye信息后模型預測更準確。

補充圖3E,F討論了其它免疫特征與OS的關(guān)系，某些腫瘤類型中免疫亞型與OS的關(guān)系

Figure 3. Immune Response and Prognostics

免疫反應與體細胞變異

6中免疫亞型的免疫浸潤（白細胞比例LF）與DNA損傷（包括CNV負荷、非整倍性、雜合性丟失LOH、同源重組缺陷HRD、腫瘤內(nèi)異質(zhì)性ITH）的相關(guān)系數(shù)熱圖，圖4A。發(fā)現(xiàn)LF與C6和C2的相關(guān)性最強，從整體來看與非整倍性、LOH、HRD及突變負荷成正相關(guān)。

圖B顯示平均LF值在1-22號染色體上的觀察值與預估值間的差異，左右圖分別為拷貝數(shù)擴增和缺失，黑色部分代表差異顯著。揭示了LF與拷貝數(shù)變異的相關(guān)性，如：chr1p擴增，LF高于預估值，缺失則LF低于預估值，據(jù)此進一步將該位置上的重要基因的CNV與免疫浸潤相聯(lián)系。

基因的平均LF預估值：每種腫瘤的平均IF的平均值由每種疾病類型中存在的“擴增/缺失”樣品的數(shù)量加權(quán)。

補充圖4探討了腫瘤內(nèi)異質(zhì)性ITH與預后、LF、免疫亞型間的關(guān)系。

將299個癌癥驅(qū)動基因的突變與免疫亞型相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)33個顯著相關(guān)的基因，圖C。

圖D為LF-驅(qū)動基因變異火山圖，x軸為基因變異與LF的多因素相關(guān)性（考慮了腫瘤類型和突變數(shù)量），y軸為顯著性，橙色即為與LF顯著相關(guān)的驅(qū)動基因變異。其中23個驅(qū)動基因變異與LF增加相關(guān)，12個與LF降低相關(guān)。

補充圖4C分析了體細胞變異（突變+CNVs）對8種癌信號通路的影響。

Figure 4. Immune Response and Genome State

人口統(tǒng)計學因素及遺傳變異與免疫反應

考察了不同腫瘤類型中免疫細胞與性別和祖源的相關(guān)性，圖4E。發(fā)現(xiàn)在某些腫瘤中，女性的PD-L1表達高于男性，非洲血統(tǒng)患者PD-L1表達較低。

免疫原性調(diào)查

文章中的免疫原性主要討論的是新抗原負荷，即SNV和Indel突變產(chǎn)生的預測能與pMHC結(jié)合并誘導免疫反應的肽。

MHC proteins(pMHC)：指一些列細胞表面蛋白，主要作用是結(jié)合抗原并將其呈遞至細胞表面，使其被T-cell識別，即幫助免疫系統(tǒng)識別外來物質(zhì)。

突變與pMHC：圖5A為與突變數(shù)量相關(guān)的pMHCs數(shù)量分布，標注了源于超過40個突變的pMHCs。99.8的pMHC由單突變產(chǎn)生，0.2%是由不同突變產(chǎn)生的相同pMHC。

常見pMHC：圖5B為y軸表達共有pMHC的腫瘤數(shù)，標注了產(chǎn)生最常見pMHC的已知癌基因(PIK3CA, KRAS, BRAF等)

補充圖5A,B討論了pMHC數(shù)與預后的關(guān)系：在多數(shù)腫瘤中pMHC數(shù)與生存無關(guān)，但在某些免疫亞型中，pMHC數(shù)與PFI預后相關(guān)。

補充圖5C討論了病毒與腫瘤中免疫特征的關(guān)系，病毒含量會影響免疫細胞的組成。

Figure 5. The Tumor-Immune Interface

癌癥中的適應性免疫受體庫

適應性免疫Adaptive immune：又稱獲得性免疫，對特定病原體具有高度特異性。獲得性免疫系統(tǒng)的細胞是T和B淋巴細胞。B細胞主要參與體液免疫，而T細胞則參與細胞免疫。B細胞和T細胞都攜帶能夠識別特定靶標的受體分子。

T細胞負責識別“非自身”靶標，如病原體，但需要一種被稱為主要組織相容性復合體（MHC）呈遞抗原之后才能實現(xiàn)。B細胞抗原特異性受體則是位于B細胞表面的抗體，負責識別病原體，不需要經(jīng)過抗原呈遞。

免疫球蛋白immunoglobulin，又稱抗體，由適應性免疫系統(tǒng)的B細胞分泌。

根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)評估TCR(T cell receptor)α和β、免疫球蛋白重鏈和輕鏈庫。

發(fā)現(xiàn)TCR多樣性值因免疫亞型而不同(圖5C)，C6和C2的多樣性最高。（補充圖5D展示了不同腫瘤類型的TCR多樣性）

評估CDR3的α和β鏈，以確定具有相同TCR的患者頻率。圖5C為CDR3α-CDR3β pairs，顏色代表p值，圓的大小代表sample數(shù)目，至少在2種腫瘤中出現(xiàn)的α-β pairs有2812個。

檢驗SNV特異性pMHC-CDR3 pairs，圖5D展示了206個pMHC-CDR3α pairs和196個pMHC-CDR3β pairs。（說明這些患者中抗原受體多，抗原少，多數(shù)T細胞抗原反應是由公共抗原介導）

抗原受體通常由位于重鏈和輕鏈上的兩個可變結(jié)構(gòu)域組成，每個可變結(jié)構(gòu)域上有三個非連續(xù)排列的CDR（CDR1，CDR2和CDR3）

Complementarity-determining regions, CDR: 互補決定區(qū)，是免疫球蛋白（抗體）和T細胞受體中可變鏈的一部分，分別由B細胞和T細胞產(chǎn)生，與其特異性抗原結(jié)合。作為分子中變化最大的部分，CDR對淋巴細胞產(chǎn)生的抗原特異性的多樣性至關(guān)重要。

在某些腫瘤類型中，TCR多樣性與PFI改善相關(guān)，見補充圖5F。

免疫球蛋白重鏈和輕鏈的多樣性模式與TCR類似。

免疫調(diào)節(jié)劑的調(diào)控

免疫調(diào)節(jié)劑(Immunomodulators, IM)基因的情況可以反映癌細胞對腫瘤微環(huán)境(TME)的調(diào)節(jié)。

IM基因的表達在免疫亞型中不同（圖6A），圖6B為亞型間差異最大的基因EDNRB和CXCL10的表達值。

許多IM的甲基化程度與表達值負相關(guān)，即表觀遺傳沉默（圖6A），如圖6C的C3亞型中的CD40基因。

294個miRNA可能是IM基因的調(diào)節(jié)因子，補充圖6C。

拷貝數(shù)改變影響多個IM，并在免疫亞型中存在差異。C1,C2亞型中IM基因頻繁擴增和缺失，C3和C5中IM基因變異較少（圖6A）。KIR2DL3等基因在C5中明顯缺失，CD40等基因常在C1中發(fā)生擴增（圖6D）。

圖6A熱圖中的擴增/缺失頻率：obs是指特定亞型中IM基因擴增/缺失頻率，exp是指全部樣本中擴增/缺失頻率的差異，熱圖反映的是obs與exp的差異

Figure 6. Regulation of Immunomodulators

免疫反應的網(wǎng)絡調(diào)控

免疫應答由腫瘤細胞、免疫細胞、基質(zhì)細胞中的細胞內(nèi)分子網(wǎng)絡狀態(tài)和細胞外通訊網(wǎng)絡（包括細胞間直接互作、通過可溶性蛋白或細胞因子通訊）構(gòu)成。

根據(jù)FANTOM5中記錄的信息獲得配體 - 受體，細胞 - 受體和細胞 - 配體對的網(wǎng)絡，圖A,B,C分別是提取的IFM-γ, TGF-β, T細胞的細胞外通訊子網(wǎng)絡網(wǎng)絡。展示了免疫亞型間的一些關(guān)聯(lián)，例如C2,C3中，CD4 T細胞、CD8 T細胞和NK細胞都與IFM-γ及CCL5的表達相關(guān)；C2,C3,C6中，多種細胞都與TGF-β的表達相關(guān)……

構(gòu)建泛癌癥轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡，關(guān)聯(lián)基因組事件 - 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 - 下游靶基因 - 免疫浸潤-預后 。使用Master Regulator(MR)和SYGNAL兩種互補的方法，產(chǎn)生了2個轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡：

• 圖D是Master Regulator(MR)-Pan-Immune網(wǎng)絡，26個MRs(橙色填充)代表基因表達與LF相關(guān)的hub，連接15個上游driver events(橙色環(huán))。

• SYGNAL-PamImmune網(wǎng)絡，包含了171個富集且與LF相關(guān)的的IMs，主要展示下游調(diào)控網(wǎng)絡（突變 - 轉(zhuǎn)錄因子 - miRNA間的聯(lián)系）。（圖7E展示部分SYGNAL-PamImmune網(wǎng)絡）

MRs網(wǎng)絡圖的構(gòu)建過程：根據(jù)下游靶基因的表達變化，推斷影響蛋白質(zhì)活性的轉(zhuǎn)錄因子，為MRs → 根據(jù)蛋白互作尋找與MRs相關(guān)的發(fā)生變異的蛋白cMRs(與LF的相關(guān)系數(shù)高的優(yōu)先) → 尋找與cMRs相關(guān)的mutation和CNVs事件。

SYGNAL網(wǎng)絡構(gòu)建過程：用高表達的基因作為input，得到具有轉(zhuǎn)錄因子和miRNA共調(diào)節(jié)的基因(bicluster) → 過濾篩選得到171個與免疫浸潤和免疫調(diào)節(jié)均顯著相關(guān)的biclusters→ 添加biclusters的轉(zhuǎn)錄因子和miRNA調(diào)控信息 → 整合這些調(diào)控關(guān)系，連接成網(wǎng)絡

（網(wǎng)絡圖構(gòu)建步驟比較復雜，大致應該是這個意思）

綜合2個調(diào)控網(wǎng)絡，MR及SYGNAL中有7個共享的TFs，調(diào)節(jié)27個IM基因，推斷AKAP9, HRAS, KRAS和PREX2基因突變影響IMs。

圖7E展示免疫亞型-IM基因表達調(diào)控-腫瘤類型間的關(guān)系，可以鑒定不同免疫亞型內(nèi)的IM基因調(diào)控因子。例如，C1和C2中的IM基因共同受BCL5B, ETV7, IRF1, IRF2, IRF4, PRDM1, 和SPIB調(diào)控；C3中IM受KLF15 and miR-141-3p調(diào)控……

某些腫瘤中，bicluster的表達增加與預后相關(guān)，在KIRC, LGG, LUSC和READ中預后差，在SKCM中預后好。

Figure 7. Predicted Networks Modulating the Immune Response to Tumors

結(jié)果總結(jié)

文章利用TCGA數(shù)據(jù)構(gòu)建了癌癥的免疫基因組學圖譜：

• 根據(jù)5種免疫表達特征將TCGA的腫瘤分為6種免疫亞型

• 通過多種方法評估腫瘤樣本中的免疫組成，包括：根據(jù)基因表達和甲基化數(shù)據(jù)估計免疫細胞組成、預測來自突變和HLA-typing的新抗原-MHC pairs、根據(jù)RNA測序數(shù)據(jù)評估BCR和TCR庫。

• 比較癌癥和免疫亞型的免疫組成

• 鑒定與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的體細胞變異

• 構(gòu)建影響腫瘤微環(huán)境的分子調(diào)控網(wǎng)絡及細胞間通訊網(wǎng)絡

• 聯(lián)系免疫特征與生存，OS和PFI在腫瘤間或一些腫瘤內(nèi)的免疫亞型中存在差異

數(shù)據(jù)和結(jié)果的補充表格下載地址：https://gdc./about-data/publications/panimmune （劃重點?。。。?/p>

文章很清晰，做了pan-cancer的免疫亞型分類，然后把能用到的所有基因組指標和免疫指標都進行了分組比較。文章的數(shù)據(jù)量很大，用到的方法很多，方法介紹也寫得很詳細，需要時可以再詳細了解；補充表格的數(shù)據(jù)有很多信息可以直接拿來用，避免重復分析一次。