內(nèi)參基因是指其表達水平不受研究條件的影響且可以在多種樣本間恒定表達的已知參照基因。用這個基因的表達水平可以準確量化初始材料的載量。由于管家基因的表達水平受環(huán)境因素影響較小，并能在生物體幾乎全部組織及各個生長階段持續(xù)表達，所以在試驗中通常選用管家基因作為內(nèi)參基因，然而，管家基因在部分不同組織或不同處理條件下其轉(zhuǎn)錄水平可能會發(fā)生變化，所以，迄今為止尚未找到理想的內(nèi)參基因。目前進行qRT-PCR定量基因表達的方法主要有兩類，即絕對定量法和相對定量法。

絕對定量法能夠獲得基因表達的準確表達量。但針對不同的目的基因，需要構(gòu)建不同的標準品，大大增加試驗的難度和復(fù)雜性。因此，利用qRT-PCR技術(shù)測定基因的表達量時。往往不是直接測定目的基因的絕對表達量，而是分別測定目的基因和內(nèi)參基因的表達量。并把內(nèi)參基因的表達量作為一個標準來測出目的基因的相對表達量，最后再進行樣品間相對表達量的比較。與絕對定量法相比相對定量法簡單、準確并且高效，應(yīng)用十分廣泛，但其需要選擇合適的內(nèi)參基因。

在用相對定量法測定基因的表達水平時，還需要考慮數(shù)據(jù)如何呈現(xiàn)。qRT-PCR得到的CT值是指數(shù)關(guān)系，不是線性關(guān)系，因此不能將CT值直接用于需要數(shù)據(jù)正態(tài)分布的統(tǒng)計分析方法如t檢驗和方差分析(ANOVA)方法中，所以統(tǒng)計數(shù)據(jù)時應(yīng)先將原始CT值進行2^-CT轉(zhuǎn)換，使數(shù)據(jù)達到線性關(guān)系后再進行統(tǒng)計分析。在用相對定量法得到數(shù)據(jù)后，進行數(shù)據(jù)分析時常用比較CT值法(2^-△△CT法)。此方法基于2個假設(shè)：①擴增效率為100％，即每個PCR循環(huán)產(chǎn)物的量都翻倍，可以通過擴增效率的驗證來解決；②有合適的內(nèi)參基因校正上樣量的誤差。

內(nèi)參基因通常是各種管家基因，各類管家基因在生物體各類細胞中都表達。然而，在不同的物種及不同類型的組織中管家基因的表達也具有特異性。已有的研究結(jié)果表明，在所有組織、發(fā)育時期、生理條件下均穩(wěn)定表達的理想內(nèi)參基因并不存在，所以其表達的穩(wěn)定性是相對的(表1)，需要研究者根據(jù)自己的樣品類型及試驗條件來選擇合適的內(nèi)參基因。

表1 已報道的部分物種qRT-PCR內(nèi)參基因

很多qRT-PCR試驗只選擇單一的內(nèi)參基因來校正與標準化目的基因的表達，其中常用內(nèi)參基因有GAPDH，β-actin、18S rRNA和28S rRNA等。

3.1 GAPDH

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是糖酵解、糖異生及光合作用過程中碳固定循環(huán)中的關(guān)鍵酶，是最常用的內(nèi)參基因之一。但是，許多研究表明GAPDH在某些特定條件下其表達存在不穩(wěn)定性。如Robert等人根據(jù)GAPDH在人類72個不同組織中的表達研究，結(jié)果顯示GAPDH表達量最高的骨骼肌組織相對于表達量最低的乳房組織，其表達量竟相差了15倍。Glare等人利用qRT-PCR技術(shù)檢測GAPDH在支氣管肺泡灌洗回收液里的細胞和支氣管內(nèi)膜活檢組織中的表達時，發(fā)現(xiàn)其在支氣管患者組織的表達量低于正常人組織的表達量。因此，GAPDH在上述條件下作為內(nèi)參基因遭到質(zhì)疑。

3.2 β-actin

β-actin是肌動蛋白的一種，存在于所有真核細胞中且高度保守，因此常被作為內(nèi)參基因廣泛使用。Nygard等人應(yīng)用熒光染料實時定量PCR方法研究不同基因在豬的不同組織表達水平的穩(wěn)定性時，發(fā)現(xiàn)β-actin穩(wěn)定表達。然而，在一些特定組織及試驗條件下，β-actin表達量同樣很不穩(wěn)定。如Glare等人發(fā)現(xiàn)在哮喘氣道內(nèi)β-actin表達不穩(wěn)定；Bas等人利用qRT-PCR技術(shù)分析常用內(nèi)參基因在人類T淋巴細胞中的表達穩(wěn)定性試驗中，研究結(jié)果也表明β-actin不適合作為內(nèi)參基因。

3.3 18S rRNA和28S rRNA

rRNA即核糖體RNA，它由不同于mRNA合成的RNA聚合酶所合成，因此rRNA合成的調(diào)節(jié)獨立于mRNA。通常在影響mRNA表達的條件下，各種rRNA水平很少發(fā)生變化，但是其表達易受到各種生物因素和藥物的影響。在有絲分裂時期，18S rRNA和28S rRNA明顯減少或停止表達，而且當對已純化mRNA中的目標基因進行定量時，rRNA不能用于標準化；rRNA還高豐度表達，遠遠高于目標基因的表達量，且其不包括poly(A)尾，在以O(shè)ligo(dT)為引物的cDNA合成中不能被逆轉(zhuǎn)錄等缺陷。這些都是18S rRNA和28S rRNA作為內(nèi)參基因的缺點。

正確選擇內(nèi)參基因，很大程度上依賴于所研究的細胞或組織及試驗條件，不同的試驗需要尋找適合試驗體系的內(nèi)參基因。常用的內(nèi)參基因在某些細胞或組織及試驗條件下雖然能夠穩(wěn)定表達，但在一些特定因素下表達量變化卻很大。所以，使用qRT-PCR技術(shù)研究目的基因的表達情況時，需要根據(jù)樣品類型及試驗條件的不同，選擇合適的內(nèi)參基因作為標準。隨著科技的進步，近年來出現(xiàn)了篩選穩(wěn)定性好的內(nèi)參基因的新方法，如使用GeNorm軟件、基因芯片數(shù)據(jù)、EsT數(shù)據(jù)庫。

4.1 基于軟件選擇內(nèi)參基因

在qRT-PCR中，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性非常重要，直接影響著試驗結(jié)果的準確性。許多學者建議，在應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)進行表達分析時，可以選擇多個內(nèi)參基因作為校正標準。另外GeNorm、NormFinder和BestKeeper程序也可以用來比較內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性。GeNorm是由Vandesompele等人編寫的專門用于qRT-PCR選擇內(nèi)參基因的程序，該程序可以計算出顯示內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的M值，M值越大表明基因表達的穩(wěn)定性越差，反之，基因表達的穩(wěn)定性越好。NormFinder程序由Andersen等人編寫，運行原理與GeNorm程序相似，但只能選出一個合適的內(nèi)參基因作為標準。BestKeeper由Pfaffi等人針對內(nèi)參基因和目標基因進行選擇所編寫的程序，其功能強大，不僅可以分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，還可以比較目的基因的表達水平。

4.2基于基因芯片數(shù)據(jù)選擇內(nèi)參基因

隨著人類基因組計劃(HGP)的初步完成以及分子生物學科的迅猛發(fā)展，許多動植物以及微生物基因組被測定，目前基因序列數(shù)據(jù)仍在迅速增加?；蛐酒?gene chip)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的高通量、高效率的分子生物學技術(shù)，可以同時、快速、準確地分析數(shù)以千計基因組信息，并且可以自動、快速地檢測出成千上萬基因的表達情況。因此通過對基因芯片數(shù)據(jù)的分析可以發(fā)現(xiàn)在不同細胞類型和不同條件下穩(wěn)定表達的基因作為候選內(nèi)參基因。

4.3基于EST數(shù)據(jù)庫選擇內(nèi)參基因

表達序列標簽(expressed sequence tags，EST)，又稱表達序列標記，通常指來自表達基因片段3’端或5’端特異性代表一個基因部分信息的短脫氧核糖核酸序列，它可以代表生物體某種組織某一時間的一個表達基因。生物體內(nèi)可以表達的基因序列只占整個基因組序列的極少部分，而EST所代表的cDNA序列正是反映這些表達基因的編碼部分，所以根據(jù)EsT可以直接獲得基因表達的信息。對cDNA文庫公共數(shù)據(jù)庫中的EST序列進行分類。尋找在特定cDNA文庫中出現(xiàn)頻率較高即表達豐度較高的EST序列，再結(jié)合網(wǎng)絡(luò)搜索這些基因在不同試驗條件下的表達譜，從而篩選出穩(wěn)定性較好的候選內(nèi)參基因。

以往的qRT-PCR試驗通常只選擇單一的內(nèi)參基因作為校正標準，而近年的研究表明常用的內(nèi)參基因，如GAPDH、β-actin、18S rRNA和28S rRNA在一些細胞組織和試驗因素下表達都不太穩(wěn)定。在試驗過程中為了確保獲得可靠的試驗結(jié)果，研究者需根據(jù)自己的樣本情況和試驗條件，篩選出合適的內(nèi)參基因作為目的基因的校正標準，保證試驗結(jié)果的可靠性。