為什么說(shuō)BMJ是一本神奇的雜志？對(duì)于做腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的“科研民工”而言，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是再熟悉不過(guò)了。但是再簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)也會(huì)栽跟頭，這不，因?yàn)榇中拇笠猓仪昂笞隽藘芍芏嗟臒o(wú)用功，在此，基于自己失敗的教訓(xùn)，給大家做一點(diǎn)總結(jié)。

我為什么會(huì)選擇做細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)？

1）一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移的過(guò)程；

2）適合研究細(xì)胞與胞外基質(zhì)（ECM）、細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用引起的細(xì)胞遷移。

3）與包括活細(xì)胞成像在內(nèi)的顯微鏡系統(tǒng)兼容，可用于分析細(xì)胞間的相互作用。

4）簡(jiǎn)單、便宜。（重中之重）

要準(zhǔn)備哪些材料？

做細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，基本上不需要額外買(mǎi)設(shè)備，準(zhǔn)備：細(xì)胞樣品、6孔板（基于個(gè)人實(shí)驗(yàn)需要）、marker筆、直尺、槍頭、試劑、無(wú)血清培養(yǎng)基、PBS，所有需要的器材都要滅菌，超凈工作臺(tái)紫外線(xiàn)消毒至少30min。

該實(shí)驗(yàn)一般適用于上皮，纖維樣細(xì)胞系，本身有遷移能力，且較強(qiáng)；有極性，方便測(cè)量，觀(guān)察；對(duì)無(wú)血清有較強(qiáng)的忍受力。

操作步驟？

1）我習(xí)慣于在六孔板背面每隔1cm畫(huà)上一條直線(xiàn)，方便之后鏡下觀(guān)察每個(gè)區(qū)域。每個(gè)孔加入5*105個(gè)細(xì)胞（可以根據(jù)牛鮑計(jì)數(shù)板確定自己合適的稀釋倍數(shù)）

注：數(shù)量以過(guò)夜貼壁能鋪滿(mǎn)為宜，適當(dāng)調(diào)整；數(shù)量少時(shí)可培養(yǎng)一段時(shí)間至鋪滿(mǎn)板底。這就第一個(gè)坑，第一次做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，并沒(méi)有理解鋪滿(mǎn)到底有多滿(mǎn)，一定要等到細(xì)胞鋪滿(mǎn)，彼此之間沒(méi)有空隙，否則會(huì)影響后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2）待細(xì)胞鋪滿(mǎn)后，用200ul槍頭垂直于孔板和線(xiàn)制造細(xì)胞劃痕，盡量保證各個(gè)劃痕寬度一致, 人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這也是該方法最大的缺陷，有條件的同學(xué)可以選擇culture Insert（如下圖），將細(xì)胞接種于Dish中間的Insert，培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)Insert 區(qū)域后用鑷子移除Insert即可產(chǎn)生500um寬度的劃痕

不過(guò)我查了一下價(jià)格，有一丟丟小貴，所以還是選擇了槍頭代替，其實(shí)多練幾次，效果也是不錯(cuò)的，捂臉說(shuō)到底還是為了省錢(qián)。

3）吸掉舊培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞后，再加入無(wú)血清培養(yǎng)基，根據(jù)需要設(shè)加實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組。

注：沖洗時(shí)溫柔，貼壁加入，避免沖掉單層細(xì)胞，反復(fù)多次沖洗，盡量洗掉所有的細(xì)胞碎片，否則會(huì)影響拍照效果。

4）放入37度5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，6，12，24小時(shí)拍照（觀(guān)察時(shí)間根據(jù)個(gè)人實(shí)驗(yàn)需要）。一般為上述時(shí)間，時(shí)間太久，細(xì)胞繁殖，假陽(yáng)性。

注：這是第二個(gè)坑，一般情況下，大家都會(huì)設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組都是加了各種抑制或促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)的藥物，建議不要把觀(guān)察時(shí)間設(shè)置的太長(zhǎng)，因?yàn)楹苋菀自斐杉?xì)胞污染死亡或者過(guò)度增殖造成的假陽(yáng)性結(jié)果。

5）圖像數(shù)據(jù)分析。我習(xí)慣于用Image Pro Plus進(jìn)行分析，其實(shí)ImageJ也是可以的。打開(kāi)軟件，點(diǎn)擊file→open，選擇你需要處理的圖片（HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）。

選擇區(qū)域之前，可以先對(duì)圖片處理一下，加強(qiáng)細(xì)胞的輪廓。點(diǎn)擊process→filters→edge→sobel→點(diǎn)擊apply，效果如圖所示。

中間黑色的劃痕區(qū)域可以用描繪工具中的魔棒工具來(lái)選擇。點(diǎn)擊irregular AOI→NEW AOI，圈選中間黑色的劃痕區(qū)域。

接下來(lái)開(kāi)始測(cè)量，除了測(cè)量面積之外，還可以測(cè)量外框長(zhǎng)度，也就是劃痕的長(zhǎng)度，也就是圖片的整體高度。點(diǎn)擊count/size→measure→select measurements→Box Height（這就是劃線(xiàn)的長(zhǎng)度）。

點(diǎn)擊edit→convert AOI(s) to Object(s) →view→meaurement data。

劃痕的平均寬度=Area/Box Height，例如圖中數(shù)據(jù)654727/1200≈545.61

注：一個(gè)要注意的問(wèn)題，隨著細(xì)胞的不斷遷移，劃痕會(huì)不斷縮小，在計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度的縮小時(shí)，不要計(jì)算其相除的比例值，而是要計(jì)算想減的差值。

好了，今天就策到這里，希望對(duì)大家有幫助。