本研究對(duì)早發(fā)型乳腺癌（≤40歲）或有乳腺癌和(或)卵巢癌家族病史的240名中國(guó)婦女的283個(gè)癌相關(guān)基因進(jìn)行靶向測(cè)序，并使用新策略對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的基因變異。

先前的GWAS研究確定了許多與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的常見(jiàn)變異，但相同遺傳變異在不同種族之間的等位基因頻率不同，對(duì)不同人種造成疾病易感性的程度也不同。因此，對(duì)單一人口進(jìn)行的研究可能并不完全適用于其他人群。GWAS在識(shí)別乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)基因方面非常成功，但先前的研究多取樣于歐洲人，確定的風(fēng)險(xiǎn)基因位點(diǎn)并不完全適用于亞洲人群。

• 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)基因位點(diǎn)超過(guò)一千個(gè)。

• 樣本：

• 發(fā)現(xiàn)階段：對(duì)早發(fā)型乳腺癌（≤40歲）或有乳腺癌和(或)卵巢癌家族病史的240名婦女的283個(gè)癌相關(guān)基因進(jìn)行下一代靶向測(cè)序。

• 驗(yàn)證階段：1516例中國(guó)血統(tǒng)的女性乳腺癌患者樣本（來(lái)自 NCCS 和Singapore General Hospital 招募的患者，及SingHealth Tissue Repository檔案凍結(jié)外周血樣品）。對(duì)照組為1189名中國(guó)血統(tǒng)的健康女性樣本（樣本來(lái)自the DNA Diagnostic and Research Lab, KK Women’s and Children’s Hospital, Singapore）

• 方法：Variant filtering；SNP selection；SNP genotyping analysis；SNP association analysis；Detection of amino acid conservation；Protein structure stability prediction

• 發(fā)現(xiàn)的乳腺癌相關(guān)基因：

• SNP rs56118985(位于9p24.1/JAK2）

• SNP rs200504060(位于19p13.12/NOTCH3）

• SNP  rs142179458 (位于14q23.2/HIF1A）

• 概念驗(yàn)證研究

• 樣本數(shù)據(jù)：從240名有乳腺癌和(或)卵巢癌家族病史（一級(jí)和/或二級(jí)親屬具有乳房和/或卵巢癌）或患有早發(fā)性乳腺癌女性中獲得DNA樣本

• 方法：確定樣本中MAF> 1％，但在一般人群中MAF≤1％的并在1516例樣本和1189例對(duì)照組中通過(guò)高通量基因分型選擇后的24個(gè)編碼變異

• 驗(yàn)證：使用近代1,516個(gè)中國(guó)女性乳腺癌患者的DNA樣本進(jìn)行驗(yàn)證

• Variant filtering and SNP selection

• 分析部位：外顯子及外顯子兩端+/- 50bp內(nèi)含子區(qū)域的變異

• 過(guò)濾：1000 Genomes Projec和 ExAC databases 中MAF ≤1%的突變

• 保留：具有PhyloP（20）保守評(píng)分為大于或等于0的變異，CADD得分大于或等于10的變異

• SNP genotyping

• 工具：192.24 Dynamic ArrayTM

• 方法：Fluidigm SNP Genotyping Analysis software分析SNP（基于k-means clustering）

• SNP association analysis

• 對(duì)象：SNP genotype data

• 工具與方法：R包SNPassoc（以95％置信區(qū)間估計(jì)每個(gè)等位基因的OR值）

• Detection of amino acid conservation

• 工具：ConSurf analysis；R Bioconductor package msa  

• 方法：利用同源序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系來(lái)識(shí)別蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的保守位置

• Protein structure stability prediction

• 工具：I-Mutant2.0；INPS-MD；the HOPE server  

• 對(duì)象：NABI下載的genes JAK2, NOTCH3, and HIF1A的蛋白序列

1. 變異篩選

• 檢測(cè)到217個(gè)基因的1154個(gè)外顯子和剪接變體（不包括同義突變）

• 過(guò)濾注釋（按圖1流程）后，得到 106個(gè)基因中的204個(gè)變異

• 研究發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)的變異與乳腺癌發(fā)生相關(guān)，作者篩選了24種樣本中發(fā)生率最高的變異來(lái)確定它們與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性

• 24個(gè)SNP都不包括在商業(yè)上可購(gòu)買的Illumina和Affymetrix基因分型陣列中

• 24個(gè)SNP中有5個(gè)在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中被確認(rèn)為是單型，并將之剔除

圖1 過(guò)濾注釋流程

2. 19個(gè)SNP與臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)

• 臨床病理參數(shù)：ER, PR, HER2status; sporadic breast cancer,  FH  

• 乳腺癌相關(guān)基因：

• SNP rs56118985（位于9p24.1/JAK2）在乳腺癌sporadic，PR-negative breast亞型中與乳腺癌顯著相關(guān)

• SNP rs200504060(位于19p13.12/NOTCH3）在sporadic，ER-positive以及HER2-positive亞型中與乳腺癌顯著相關(guān)

• SNP rs142179458 （14q23.2/HIF1A）在HER2-negative亞型中與乳腺癌顯著相關(guān)

3.  氨基酸保守值預(yù)測(cè)

• JAK2蛋白（SNP：rs56118985）的第127位氨基酸得分在6到7之間（適度保守），根據(jù)ConSurf的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法預(yù)計(jì)是一個(gè)裸露殘基（exposed residue ）

• NOTCH3蛋白（SNP：rs 200504060）的第1175位氨基酸殘基得分3分（可能較不保守）

• HIF1A蛋白（SNP：rs142179458）的第349位氨基酸殘基得分3分（可能較不保守）

• 基于多重序列比對(duì)的ClustalOmega方法顯示了不同物種對(duì)于所有位點(diǎn)均保守（圖 2A-C)

圖 2  氨基酸保守值預(yù)測(cè)

4. 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析

• JAK2蛋白（ SNP rs56118985）

• 軟件I-Mutant2.0 and INPS-MD 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)對(duì)G127D突變的穩(wěn)定性降低

• HOPE server  預(yù)測(cè)突變型殘基量大于野生型。此外，突變使蛋白質(zhì)電性從中性變?yōu)閹ж?fù)電，增加了蛋白質(zhì)疏水性

• NOTCH蛋白（SNP rs200504060）

• 軟件I-Mutant2.0 and INPS-MD 預(yù)測(cè)突變可降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

• HOPE server  預(yù)測(cè)突變導(dǎo)致氨基酸電荷從陽(yáng)性變?yōu)橹行?/span>

• HIF1A  蛋白（SNP rs142179458  ）

• 軟件I-Mutant2.0 and INPS-MD 預(yù)測(cè)突變可降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

• HOPE server  預(yù)測(cè)突變使氨基酸電荷從負(fù)電性變?yōu)橹行?，而氨基酸性質(zhì)的差異可能擾亂其蛋白質(zhì)功能

本研究通過(guò)使用新策略分析靶向測(cè)序（targeted sequencing）數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，中國(guó)人的JAK2、NOTCH3、HIF1A基因的變異與乳腺癌相關(guān)，在其它族群中這些基因是否與乳腺癌相關(guān)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。研究結(jié)果表明，通過(guò)本文的數(shù)據(jù)過(guò)濾流程，利用二代測(cè)序數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)的新的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。研究中發(fā)現(xiàn)的3個(gè)SNP突變都是低頻（1％<>

參考文獻(xiàn)：

[1] Claire Hian Tzer Chan , Prabhakaran Munusamy, et al. Identification of Novel Breast Cancer Risk Loci[J]. Cancer Research, 2017.