開(kāi)發(fā)了一種基于cell-free DNA 甲基化譜的超靈敏癌癥檢測(cè)方法，通過(guò)概率模擬進(jìn)行信號(hào)放大，解決了cell-free DNA中腫瘤DNA的痕量問(wèn)題。在實(shí)際血漿數(shù)據(jù)測(cè)試上，CancerDetector 得到了高靈敏性和特異性的結(jié)果。

癌癥早診是提高癌癥存活率的最佳方法，使用來(lái)自血液的cell-free DNA（cfDNA）的非侵入式檢測(cè)方法是一個(gè)熱點(diǎn)。但是在最早期和許多晚期癌癥患者的血液中腫瘤cfDNA水平非常低。解決這一問(wèn)題的主流方法是使用靶向深度測(cè)序結(jié)合錯(cuò)誤抑制技術(shù)，但是要獲得良好的效果成本過(guò)高。本研究的目的即使解決檢測(cè)痕量腫瘤cfDNA的挑戰(zhàn)。

基于兩點(diǎn)原因本研究選擇了基于甲基化數(shù)據(jù)的腫瘤cfDNA檢測(cè)，（i）DNA甲基化模式是普遍存在的，（ii）異常的DNA甲基化模式發(fā)生在癌癥早期。該方法的關(guān)鍵是關(guān)注單個(gè)cfDNA測(cè)序read上多個(gè)相鄰CpG位點(diǎn)的聯(lián)合甲基化狀態(tài)，以利用DNA甲基化的普遍性質(zhì)進(jìn)行信號(hào)放大。

該文章針對(duì)肝癌數(shù)據(jù)進(jìn)行了演示，但是該方法可以推廣到任何癌癥類(lèi)型。方法主要包括三個(gè)主要步驟：（i）鑒定肝癌的DNA甲基化marker，（ii）計(jì)算read含有甲基化marker的可能性，（iii）推斷cfDNA組成。

圖1 CancerDetector方法概述

鑒定和表征肝癌特異性甲基化marker

Step1:確定肝癌的基因組標(biāo)記

選擇那些甲基化水平可以區(qū)分大多數(shù)肝腫瘤樣本的區(qū)域，不僅可以與它們匹配的正常肝組織區(qū)分，還有正常血漿樣本。該任務(wù)包括兩個(gè)步驟：（i）選擇腫瘤和正常組織之間的甲基化水平差異在一半以上的“普遍差異甲基化（FDMR）”區(qū)域，用以去除肝組織特異性marker而保留肝癌特異性marker，（ii）選擇能區(qū)分腫瘤樣本和正常血漿樣本的FDMR，該步驟確?？梢栽谘褐需b定甲基化信號(hào)。因?yàn)閏fDNAs的測(cè)序覆蓋率普遍偏低，因此使用的marker越多，這些marker可能具有的質(zhì)量越低，但是可能鑒定的腫瘤衍生cfDNA read 越多，所以在實(shí)際使用時(shí)要在marker質(zhì)量和數(shù)量間做一個(gè)權(quán)衡。

Step2:甲基化模式表征模型

一個(gè)給定區(qū)域，假定一類(lèi)（T class和N class）中的所有樣本的甲基化水平服從β分布，marker  屬于 T(tumor) class 和 N(normal) class 的概率分別服從和。為了簡(jiǎn)化符號(hào)，定義 。

計(jì)算read屬于每一類(lèi)的可能性

定義所有個(gè)markers的甲基化模式為

定義一個(gè)病人覆蓋M個(gè)CpG位點(diǎn)的所有N個(gè)read的甲基化數(shù)據(jù)集為

對(duì)于一個(gè)read，其來(lái)自class c的概率為。定義為腫瘤來(lái)源的cfDNA分?jǐn)?shù)，1-

為正常組織來(lái)源的cfDNA分?jǐn)?shù)，目標(biāo)是計(jì)算出使最大化的,這就轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)最大似然問(wèn)題。假設(shè)概率依賴(lài)于每一個(gè)read，

可以進(jìn)一步擴(kuò)展為

最終只有一個(gè)需要計(jì)算的參數(shù)。

圖2 cfDNA分類(lèi)概率計(jì)算

去除具有混淆性的marker

理想狀態(tài)下早期癌癥患者的值應(yīng)該都很小，但是在真實(shí)的癌癥患者數(shù)據(jù)中，會(huì)有許多marker因?yàn)閭€(gè)體差異而具有遠(yuǎn)大于全局平均值的。這些具有混淆性的marker會(huì)損害估計(jì)的準(zhǔn)確性，研究人員通過(guò)迭代算法來(lái)去除這些具有混淆性的marker。

應(yīng)用TCGA肝癌數(shù)據(jù)對(duì)模型進(jìn)行訓(xùn)練，通過(guò)模擬數(shù)據(jù)和TCGA真實(shí)數(shù)據(jù)對(duì)模型進(jìn)行測(cè)試。

（i）模擬數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)證明了CancerDetector對(duì)檢測(cè)腫瘤cfDNAs的超敏感性

圖3 肝癌cfDNA樣本的預(yù)測(cè)血腫瘤分?jǐn)?shù)

（ii）真實(shí)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)證明了CancerDetector對(duì)檢測(cè)腫瘤cfDNAs的高靈敏度 

圖4 10次運(yùn)行所得到的預(yù)測(cè)腫瘤分?jǐn)?shù)（A）CancerDetector的標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均ROC曲線，（B）之前方法的平均ROC曲線和標(biāo)準(zhǔn)偏差，（C）基于甲基化單倍型負(fù)荷的方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均ROC曲線，（D）由CancerDetector預(yù)測(cè)的腫瘤大小和平均血液腫瘤分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系

癌癥早診的成功在很大程度上取決于（i）高質(zhì)量的癌癥特異性甲基化marker，（ii）超靈敏的計(jì)算方法。這項(xiàng)研究提出了一種新方法，通過(guò)個(gè)別read的數(shù)據(jù)來(lái)解卷積整個(gè)腫瘤cfDNA，能夠在低的測(cè)序深度下得到更好的結(jié)果。并且該方法的效果可以通過(guò)增加數(shù)據(jù)大小和質(zhì)量來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)?，F(xiàn)階段的研究可用的非癌血漿樣本數(shù)量有限，在未來(lái)拿到更多的樣本數(shù)據(jù)后，可以建立更可靠的閾值上限等參數(shù)，得到更好的檢測(cè)結(jié)果。

該研究的突破主要在于其應(yīng)用了新的計(jì)算方法，一個(gè)好的模型既要以生物學(xué)意義為前提設(shè)計(jì)，也要有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析。