我們在做免疫熒光（IF），激光共聚焦(Confocal)，凋亡檢測（TUNEL）時，免不了要制備細胞爬片，爬片質(zhì)量完全決定了最后拍照的質(zhì)量以及實驗數(shù)據(jù)的精準性。今天，醫(yī)學方小編就教大家如何制備好的細胞爬片。

爬片的準備

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爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用細胞爬片（價格比較昂貴）但是細胞貼壁牢固，拍出照片效果好；

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可根據(jù)自己的需要，到染色時再將之切開，這樣既保證了細胞均一性，又可同時做幾個指標的染色剪裁成合適大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；

細胞爬片（以常用24孔板為例）

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胰酶消化細胞后計數(shù)重懸細胞于完全培養(yǎng)基中。

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加細胞時，根據(jù)玻片的大小，先在每個孔里準備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細胞懸液時玻片漂起，造成雙層細胞貼片。整個過程注意無菌操作，玻片是無菌處理的，可以酒精燈外火焰附近做。

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根據(jù)自己的需要，選擇合適的細胞密度（細胞太密影響拍照效果），將計數(shù)分好的細胞混勻后鋪到孔中，種入24孔板一個孔內(nèi)即可。

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待細胞貼壁后，可去上清加處理組培養(yǎng)基。

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按照實驗設(shè)計，作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，小編會將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了。

如果要做諸如24h，48h，72h等不同時間點實驗的話，將所需數(shù)量的爬片取出時應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。

爬片細胞的固定處理

以下為常用的固定液：

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冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。

將純丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮（此溫度不會為固體的）細胞爬片取出后，PBS洗2遍，加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很強的揮發(fā)性，注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴，防止其揮發(fā)）固定10min。取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保存。

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多聚甲醛(常用4%)：避光保存，可用于免疫熒光以及TUNEL染色。 室溫固定15-30min后，將表面液體吹干， -20℃保存

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95％乙醇，可用于免疫組化。

優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存較好。

缺點：但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，孵育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強度。室溫固定15min后，將表面液體吹干，入-20℃保存

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甲醛

優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強，

缺點： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。

小編將以多聚甲醛為例，講講24孔板內(nèi)，細胞爬片固定步驟：

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準備多聚甲醛（PFA）： 4℃冰箱保存。

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將細胞從37℃培養(yǎng)箱取出，用預(yù)溫的PBS洗3遍，每次加入1ml PBS，輕輕晃動，避免將細胞沖掉。

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注意爬片的細胞面向上，每孔用4℃的多聚甲醛500ul即可，室溫固定30-40min，避光。

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固定后，用PBS洗三次。

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0.2-0.5%Triton X-100透化10-20min，覆蓋細胞即可。

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PBS洗三次。

如果是做免疫熒光

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后續(xù)用3%的BSA，用PBS配置，封閉1h。

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封閉后，用PBS洗三遍，按比例加入一抗，4℃過夜，若轉(zhuǎn)入熒光標簽的質(zhì)粒，要避光。

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過夜后，用預(yù)溫的PBS洗細胞，動作輕緩，可多洗一會兒，可以用慢搖床搖。

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加入用3%BSA稀釋的二抗，室溫孵育1h，避光。

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孵育結(jié)束后，避光用PBS洗3次，動作輕緩，可以多洗一會兒。

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1ug/mL DAPI ，室溫避光，染細胞核DNA 20min。

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PBS洗三次。

細胞爬片封片

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將載玻片洗好在干凈無塵紙上晾干 。

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將PBS中的細胞取出，注意細胞面朝下，載玻片上滴入亮甲油，或者防防猝滅封片劑，蓋在載玻片上（市面上可以買到封片防猝滅劑）。

細胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后做固定。根據(jù)研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡TUNEL染色時就避免洗，凋亡細胞在洗的過程中可能會脫落。

保存細胞爬片時，一般用培養(yǎng)皿或避光濕盒，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實驗時取片。然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標記，為避免混淆。一般-20℃保存2-3月的片子去拍照沒有問題的。制備好的細胞爬片是不是很簡單呢？