今天，小編在這里跟大家主要交流一下CO-IP的實(shí)驗(yàn)原理、操作方法及注意事項(xiàng)。

一、實(shí)驗(yàn)原理：

CO-IP，又叫免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。

其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Z也能沉淀下來(lái)。

目前多用proreinA預(yù)先結(jié)合固化在瓊脂糖微珠上，Protein A是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，能特異性地與人和哺乳動(dòng)物抗體的Fc區(qū)結(jié)合，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，瓊脂糖微珠上的proreinA/G與抗體Fc特異性結(jié)合，由于抗體抗原特異性，沉淀蛋白X；溶液中有和蛋白X相互作用的物質(zhì)，就能沉淀下來(lái)。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。

二、操作流程：

預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機(jī)

1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理（siRNA、過(guò)表達(dá)、藥物刺激等）；

2、收集細(xì)胞，去除培養(yǎng)基后，用預(yù)冷的1xPBS洗滌細(xì)胞2次，最后一次吸干PBS，加入預(yù)冷的RIPABuffer(1ml/10⁷個(gè)細(xì)胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶；0.5ml/5×10⁶個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶)；

3、用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，置于冰上；

4、4℃，14000g離心15min，立即將裂解液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5EP管中；

5、取少量裂解液以備Western blot分析（檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)是否是有X蛋白的表達(dá)），加入一定體積的抗X蛋白的抗體（單克隆抗體或多克隆抗體，特異性要好）到剩余裂解液中，抗體的稀釋比例因目的蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異；

6、4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h；

7、加入Protein A瓊脂糖珠和ProteinG瓊脂糖珠（建議將槍頭減為粗口，避免傷害珠子）來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1h；

8、14000rpm瞬時(shí)離心1min，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的PBS洗3遍，保留沉淀；

9、用20-60μl1×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物（四元復(fù)合物，Z蛋白-X蛋白-抗體-瓊脂糖珠）懸起，輕輕混勻；

 10、將上樣樣品在99°C煮10min，然后在14000rpm瞬時(shí)離心5min；

11、將樣品上樣到SDS-PAGE凝膠上，用western blot進(jìn)行分析。

三、注意事項(xiàng)：

（1）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100)。

（2）使用對(duì)照抗體：

單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗

兔多克隆抗體：正常兔IgG

 (3) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；

(4) 要確保抗體的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀；

(5) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。

四、常見(jiàn)問(wèn)題

（1）protein的選擇

注：protein A的載量高

Protein G可以結(jié)合更多種屬和亞型的抗體，并且結(jié)合力更強(qiáng)

二者可以單獨(dú)使用，也可以混合使用

（2）細(xì)胞裂解液的選擇？

1%的NP40可以破壞掉細(xì)胞膜，獲得胞漿蛋白

1%的TritonX-100可以破壞核膜，獲得核蛋白

（3）如何避免重鏈和輕鏈的影響？

如果目標(biāo)蛋白接近50KDa（與重鏈蛋白大小一致）的話，可以選擇特異結(jié)合輕鏈的二抗，避免產(chǎn)生干擾結(jié)果（例如B圖）；如果目標(biāo)蛋白接近25KDa（與輕鏈蛋白大小一致）的話，可以選擇特異結(jié)合重鏈的二抗，避免產(chǎn)生干擾結(jié)果。

盡管CO-IP作為研究蛋白互作經(jīng)典方法之一，仍有一定的缺點(diǎn)：（1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用。