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又到一年開學(xué)季，高校各大實(shí)驗(yàn)室又涌進(jìn)來一波波的小哥哥，小姐姐。對(duì)于初來乍到的小鮮肉來說，除了練好插槍頭的基本功外，其次就是跑好westernblot了。平時(shí)在實(shí)驗(yàn)室中，經(jīng)常會(huì)聽到一些小師弟小師妹在抱怨：“為什么好看的westernblot條帶都是別人家的，而我的條帶跑得跟shi一樣”？今天小編就帶大家一起來探討跑好wb的幾條秘籍。 1. 選擇好的抗體 眾所周知，wb的基本原理就是利用抗體與抗原的特異性結(jié)合，來檢測(cè)特定蛋白的表達(dá)。所以，首先要選好的抗體。選抗體盡可能找一些靠譜的大品牌公司的抗體(如abcam,CST,Sigma)。 下面我們介紹一個(gè)網(wǎng)站——Citeab來說明下抗體的選擇。 網(wǎng)址：https://www./ 打開以后我們可以輸入要檢索的基因名字，比如foxo3a： 我們可以在左側(cè)選擇一抗/二抗、單抗/多抗、物種、應(yīng)用技術(shù)、修飾、廠家等，比如我們選擇WB: 在文章右側(cè)就會(huì)出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的信息：在每個(gè)產(chǎn)品右側(cè)會(huì)有citations的數(shù)量，比如第二個(gè): 我們可以直接單擊View PDF查看使用這個(gè)抗體發(fā)表的文章： 2. 制備合格的樣品 制備合格的的樣品，是成功的一半。裂解液的選擇也是關(guān)鍵（裂解液的選擇參考下表）。如果要提取做IP,coIP的蛋白樣品的話，則需要選取不含SDS的裂解液。在抽提蛋白時(shí)，要在裂解液中添加蛋白酶抑制劑，如果檢測(cè)的磷酸化蛋白，則要在裂解液中添加磷酸化酶抑制劑，并且要在冰上操作，避免蛋白降解。為了充分裂解樣品，也可以選用超聲處理細(xì)胞或組織樣品，超聲能充分破碎細(xì)胞膜和剪切DNA。但如果提取用于做IP的樣品，則不建議用超聲處理樣品。 3.膠要均勻，且濃度合適 選擇合適的膠濃度并膠要配均勻（PAGE膠濃度的分離范圍如下表）。膠如果配得不均勻的話，跑出來的條帶可能不齊或出現(xiàn)“微笑”“哭臉”狀條帶。要讓條帶跑得漂亮些的話，可以提前配好膠塊，用水打濕紙巾將膠板包起來放四度冰箱過夜，第二天再跑膠。
4.選擇合適的電泳電壓 電泳的電壓要合適，電壓過高容易導(dǎo)致電泳液和膠發(fā)熱。一般選擇60-80V跑濃縮膠，而選用100-120V跑分離膠。 5.選擇合適的膜 現(xiàn)在常用的膜有PVDF膜或NC膜。PVDF膜分辨率高，背景低，具有溶劑耐受性，機(jī)械強(qiáng)度高，適合于SDS存在下與蛋白的結(jié)合。可用于常規(guī)染色，考馬斯亮藍(lán)染色，ECL和免疫檢測(cè)，使用前需用100%甲醇浸泡30秒。NC膜同樣具有高靈敏度和低背景的特點(diǎn)，但干的NC膜較脆，無溶劑耐受性，使用前用緩沖液濕潤(rùn)即可。常規(guī)染色，可用于放射性和非放射性檢測(cè)。孔徑0.45um的NC膜適用于一般蛋白，蛋白分子量小于20KD則選擇0.2um的NC膜。 6. 轉(zhuǎn)膜時(shí)間要恰當(dāng) 轉(zhuǎn)膜時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響到轉(zhuǎn)膜效果。濕轉(zhuǎn)的話，要根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量的大小選擇合適的轉(zhuǎn)膜時(shí)間（參考下表）。若使用Bio-Rad Trans-BlotTurbo System半干轉(zhuǎn)的話，則選擇2.5A 轉(zhuǎn)7-15分鐘。如果單獨(dú)半干轉(zhuǎn)一塊膠的話，則選用1.5A 轉(zhuǎn)7-15分鐘。轉(zhuǎn)膜時(shí)注意趕走氣泡。
7.選擇合適的封閉液 化學(xué)發(fā)光法：用含5%脫脂牛奶的TBST；熒光法用5%脫脂牛奶的TBS;在搖床上室溫封閉1小時(shí)。 8. 選擇合適的抗體孵育濃度 抗體的孵育濃度直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果。過高容易出現(xiàn)雜帶。相反，過低則有可能導(dǎo)致檢測(cè)到的條帶不清晰。抗體具體的稀釋濃度參照抗體說明書。一抗一般推薦四度搖床孵育過夜，二抗一般室溫孵育1-2小時(shí)。 9.洗膜 洗膜一般用TBST洗3次，每次5-10分鐘。 10.檢測(cè)條帶 第十：檢測(cè)。通常有2種方法來檢測(cè)條帶：一種是化學(xué)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光法是最廣泛的檢測(cè)方法，若二抗上標(biāo)記的過氧化物酶或辣根過氧化物酶，可以用ECL底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)時(shí)，化學(xué)發(fā)光液A液和B液要現(xiàn)配現(xiàn)用，注意避光。另外一種是熒光法，通過采用合適的熒光標(biāo)記抗體，結(jié)合oddessy儀器，實(shí)現(xiàn)多重wb分析。無須加發(fā)光液即可檢測(cè)到條帶。
以上這些就是做好wb的一些小tips,小伙伴們，你們get到了么？ |
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