一、引言

多重PCR( multiplex polymerase chain reaction,MPCR)也稱(chēng)復(fù)合PCR,是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來(lái)的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù),即可在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段,由 Chambehian'于1988年首次提出,其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與常規(guī)PCR相同。多重PCR既有單個(gè)PCR的特異性和敏感性,又較之快捷和經(jīng)濟(jì),在引物和PCR反應(yīng)條件的設(shè)計(jì)方面表現(xiàn)出很大的靈活性。多重PCR還能提供內(nèi)部對(duì)照,指示模板的相對(duì)數(shù)量和質(zhì)量

當(dāng)前臨床上對(duì)感染性疾病的診斷主要依靠傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法以及血清學(xué)方法。經(jīng)典的微生物學(xué)方法不僅繁瑣、費(fèi)時(shí),并受諸多因素影響,容易漏檢自然變異株,并且不能檢測(cè)難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的致病微生物。血清學(xué)方法雖然發(fā)展較快,靈敏度也較高,但只能做追溯性診斷或提供間接的診斷依據(jù),不能進(jìn)行快速鑒定,并且有些細(xì)菌之間有交叉凝集現(xiàn)象。因此,這些傳統(tǒng)的方法在鑒定方面日益顯現(xiàn)出不足。過(guò)去10年間,分子生物學(xué)的發(fā)展為微生物的基因型檢測(cè)和鑒定打開(kāi)了一扇大門(mén),這些發(fā)展開(kāi)始影響到患者治療的很多方面。DNA雜交研究首先應(yīng)用于確證細(xì)菌間的關(guān)系,對(duì)核酸雜交化學(xué)的認(rèn)識(shí),使發(fā)展核酸探針技術(shù)成為可能。但類(lèi)似于表型指標(biāo),在某些情況下,雜交的方法也可能受到微生物能被分離和生長(zhǎng)的限制。核酸擴(kuò)增技術(shù)又為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的病原體的檢測(cè)和鑒定鋪設(shè)了道路。體外能夠生長(zhǎng),一般來(lái)說(shuō)不再是鑒定微生物所必須滿(mǎn)足的條件。之所以能夠如此,從根本上說(shuō)是由于這些技術(shù)以特異核酸序列的酶學(xué)擴(kuò)增代替了生物學(xué)擴(kuò)增一培養(yǎng)生長(zhǎng)。雖然任何PCR依賴(lài)的技術(shù)都不能區(qū)分活的和死的細(xì)胞,但由于具有其它方法不可替代的優(yōu)勢(shì),PCR還是成為分子生物學(xué)中不可缺少的技術(shù)和方法。在過(guò)去20多年間,PCR技術(shù)和其它DNA信號(hào)與靶標(biāo)擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)使這些分子診斷技術(shù)成為臨床上快速敏感診斷的關(guān)鍵性技術(shù)。一般PCR僅應(yīng)用一對(duì)引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段,主要用于單一致病因子等的鑒定。在診斷實(shí)驗(yàn)室中,PCR技術(shù)的應(yīng)用主要受成本的限制,有時(shí)是因不能獲得足夠的待測(cè)樣本體積。為了克服以上缺點(diǎn),同時(shí)增加PCR技術(shù)的診斷能力,多重PCR的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生

自1988年 Chamberlin等首次提出這一概念起,多重PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于核酸診斷的許多領(lǐng)域,包括基因敲除分析、突變和多態(tài)性分析、定量分析1以及RNA檢測(cè)等,在感染性疾病領(lǐng)域,多重PCR技術(shù)已經(jīng)顯示出它的價(jià)值,成為識(shí)別病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)的有效方法。利用一次多重PCR反應(yīng),可同時(shí)檢測(cè)、鑒別出多種病原體,在臨床混合感染的鑒別診斷上具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和很高的實(shí)用價(jià)值

二、原理

多重PCR基本原理與常規(guī)PCR相同,區(qū)別是在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入一對(duì)以上的引物,如果存在與各對(duì)引物互補(bǔ)的模板,則它們分別結(jié)合在模板相對(duì)應(yīng)的部位,同時(shí)在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增出一條以上的目的DNA片段。多重PCR反應(yīng)體系的組成和PCR循環(huán)的條件需要經(jīng)過(guò)優(yōu)化以確保同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)片段。理論上只要PCR擴(kuò)增的條件合適,引物對(duì)的數(shù)量可以不限,但由于各種條件的限制,實(shí)際能夠擴(kuò)增的引物對(duì)數(shù)量是有限的。

PR結(jié)果的分析方法有以下幾種,包括:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、核酸雜限制性酶切分析、核酸測(cè)序等,其中瓊脂糖凝膠電泳是最簡(jiǎn)單、最快速的方法,但是與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比分辨率比較低。限制性酶切分析需要將PCR產(chǎn)物回收酶切后再次電泳,耗時(shí)費(fèi)力,難以推廣應(yīng)用。核酸測(cè)序是鑒定PCR產(chǎn)物最可靠的方法,但需要專(zhuān)門(mén)的測(cè)序儀器,并且需要花費(fèi)的時(shí)間也比較長(zhǎng)。如果要將鑒定感染性疾病病原的多重PR方法用于臨床及現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查,瓊脂糖凝膠電泳是最佳的選擇

三、材料

1.常規(guī)的PCR反應(yīng)體系所需試劑

①高壓過(guò)的超純水(高壓的目的是使其中的 DNase失活,以免降解模板DNA);

②PCR緩沖液(選用與所用聚合酶對(duì)應(yīng)的緩沖液)

③4種dNTP混合物(每種dNTP的濃度為2.5mmol/L);

④引物(引物合成后,用超純水稀釋為10mmol/L);

⑤熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(不同廠(chǎng)家、不同批次的酶可能會(huì)有差異);

⑥D(zhuǎn)NA模板(盡量使用純化后的核酸作為模板)。

2.實(shí)驗(yàn)儀器

PCR熱循環(huán)儀、核酸電泳儀、凝膠成像設(shè)備、離心機(jī)等

四、方法

多重PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)遠(yuǎn)比單個(gè)PCR復(fù)雜,并不是簡(jiǎn)單地將多對(duì)特異性引物混合成一個(gè)反應(yīng)體系,其反應(yīng)體系的組成和反應(yīng)條件需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果反復(fù)調(diào)整,以適應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)片段的需要。設(shè)計(jì)多重PCR反應(yīng)體系時(shí)必須仔細(xì)考慮其擴(kuò)增的區(qū)域、擴(kuò)增片段的大小、引物的動(dòng)力學(xué)及PCR循環(huán)條件的最優(yōu)化等。

一）選擇目標(biāo)基因

由于多重PCR在同一個(gè)反應(yīng)體系中需要加入多對(duì)引物,而模板直接影響擴(kuò)增的結(jié)果分析,這就導(dǎo)致了擴(kuò)增模板的選擇至關(guān)重要。同時(shí),擴(kuò)增區(qū)域的選擇必須符合分析的目的,如通常對(duì)于致病微生物,需要選擇其保守序列,如16sRNA,或者毒力基因、毒力相關(guān)基因,以防止檢測(cè)到非致病突變體而無(wú)法解釋結(jié)果;對(duì)于需要分型的對(duì)象來(lái)說(shuō),需要選擇它們之間有差異的保守序列進(jìn)行擴(kuò)增;對(duì)于高度同源的序列來(lái)說(shuō),可以用相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增,但獲得的陽(yáng)性結(jié)果需要利用特異探針雜交或限制性酶切進(jìn)行進(jìn)一步確定;缺失分析選擇擴(kuò)增外顯子;法醫(yī)學(xué)鑒定個(gè)體差異選擇擴(kuò)增高度多態(tài)性標(biāo)志;轉(zhuǎn)基因檢測(cè)則選擇轉(zhuǎn)入的動(dòng)植物基因座;性別鑒定一般選擇X或Y性染色體上特有的基因座

對(duì)于含有多個(gè)外顯子的基因缺失分析來(lái)說(shuō),可選擇缺失熱點(diǎn)較廣區(qū)域或缺失密集區(qū)域。相鄰近的外顯子可用跨越這兩個(gè)外顯子的引物進(jìn)行擴(kuò)增。

二)引物設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸序列,使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。因此,引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與靈敏度。要確定引物的位置,首先需要知道所選擇的基因引物與模板結(jié)合部位的詳細(xì)DNA序列信息。在多重PCR中,為了保證擴(kuò)增效率,所有的引物對(duì)必須優(yōu)化到相近的擴(kuò)增條件。因此,多重PCR的引物設(shè)計(jì)除了要滿(mǎn)足一般PCR引物設(shè)計(jì)的原則外,還要注意以下幾個(gè)問(wèn)題:①各引物之間不能互補(bǔ),尤其避免3的互補(bǔ),以免形成二聚體,引物設(shè)計(jì)好以后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以檢驗(yàn)引物之間是否配對(duì)形成二聚體;②各引物與其它擴(kuò)增片段和模板不能存在較大的互補(bǔ)性,擴(kuò)增片段之間也不能有較大的同源性;③對(duì)于引物的長(zhǎng)

度、(G+C)含量、T值要求盡量一致;④各引物擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小要有一定的差別,以便于用電泳的方法進(jìn)行區(qū)分。一般來(lái)說(shuō),產(chǎn)物片段越大,其長(zhǎng)度的差別也應(yīng)該越大。這就給多重PCR引物的設(shè)計(jì)帶來(lái)了一定的難度

(三)核酸提取

核酸依賴(lài)的檢測(cè)方法受目標(biāo)核酸純化的影響,核酸的純化程度決定了核酸方法的應(yīng)用。多重PCR的優(yōu)勢(shì)在于快速、系統(tǒng),主要用于臨床標(biāo)本的檢測(cè),包括血液、組織、糞便等,同時(shí)多重PR對(duì)核酸模板的要求比較高,所以核酸的提取純化顯得尤為重要,直接與擴(kuò)增結(jié)果

一般來(lái)說(shuō),通過(guò)煮沸裂解細(xì)菌制備模板可以滿(mǎn)足普通PCR反應(yīng),但是用于多重PCR反應(yīng)會(huì)存在很多問(wèn)題。在條件允許的情況下,多重PCR需要以純化的DNA為模板,可以確保多重PCR的順利進(jìn)行。

(四)單位點(diǎn)PCR(也叫單引物PCR)

在進(jìn)行多重PCR之前,必須先對(duì)每對(duì)引物進(jìn)行單位點(diǎn)PCR。確定每對(duì)引物進(jìn)行單位點(diǎn)PCR時(shí)條件如表14-1所列

反應(yīng)完成后比較擴(kuò)增結(jié)果,確保在相同的循環(huán)條件下所有的引物都能擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物條帶,以確保引物能夠特異性擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的目標(biāo)序列

(五)多重PCR(引物等濃度混合)

反應(yīng)體系中各對(duì)引物等濃度混合,體系中其它各成分的濃度不變,應(yīng)用與單位點(diǎn)PCR相同的反應(yīng)條件進(jìn)行多位點(diǎn)同時(shí)擴(kuò)增,根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果對(duì)多重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行調(diào)整,具體操作如下面所述

(六)優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

多重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件基本與單位點(diǎn)PCR相同,但也不能一蹴而就,必須使多重PCR反應(yīng)中每對(duì)引物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)都能獲得足夠的擴(kuò)增量,并且擴(kuò)增產(chǎn)物之間的產(chǎn)量應(yīng)該基本影響多重PCR擴(kuò)增效果的因素可以分為反應(yīng)體系和反應(yīng)條件兩大類(lèi)。其中反應(yīng)體系包括引物、緩沖液、 Taq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2等,反應(yīng)條件包括退火溫度、延伸溫度、延伸時(shí)間,循環(huán)數(shù)等

1.反應(yīng)體系的優(yōu)化

(1)引物濃度在多重PCR體系中,引物用量和擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度有著正比內(nèi)在關(guān)系,即擴(kuò)增片段越長(zhǎng),所需引物就越多,片段越短所需引物相對(duì)就越少。同時(shí),多重PCR擴(kuò)增中每增加一重PCR擴(kuò)增,引物間相互影響就加大,這就勢(shì)必影響到擴(kuò)增的效果。為了降低這種不利影響,選擇適當(dāng)?shù)囊镩g濃度是確保多重PCR成功的一個(gè)關(guān)鍵因素。先對(duì)不同的引物進(jìn)行單個(gè)PCR擴(kuò)增,確定單個(gè)PCR各引物的最佳濃度,然后按照多重PCR的實(shí)驗(yàn)流程,進(jìn)行兩個(gè)或多個(gè)引物對(duì)的多重PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)。多對(duì)引物會(huì)增加3末端引物互補(bǔ)的可能性,形成引物二聚體;也有可能發(fā)生一個(gè)擴(kuò)增片段抑制另一個(gè)擴(kuò)增片段的情況,這就導(dǎo)致了擴(kuò)增結(jié)果并不是均一的。即使在優(yōu)化了循環(huán)條件后,某些基因的擴(kuò)增產(chǎn)物仍不明顯。多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化經(jīng)常可以遇到有個(gè)或兩個(gè)靶位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物很少甚至沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物,而其它引物的擴(kuò)增效率都很好的情況。為解決這一問(wèn)題,可以通過(guò)適當(dāng)?shù)卣{(diào)整引物的相對(duì)濃度加以解決,增加弱條帶的引物量,減少亮條帶的引物量。降低擴(kuò)增效率高的引物對(duì)濃度比增加擴(kuò)增效率低的引物濃度更有助于提高擴(kuò)增效率低的產(chǎn)物的產(chǎn)量。多重PCR反應(yīng)中各引物的濃度差異一般都憑經(jīng)驗(yàn)獲得。只有在調(diào)整引物濃度達(dá)不到要求時(shí)才考慮調(diào)整別的反應(yīng)條件,例如改變反應(yīng)體系中Mg2或KC的濃度等。

有些情況,例如擴(kuò)增產(chǎn)物是序列相似但長(zhǎng)度不同的擴(kuò)增片段,最短的產(chǎn)物可能擴(kuò)增得更好,尤其是有些擴(kuò)增片段共用一個(gè)引物的時(shí)候。這種情況可以通過(guò)長(zhǎng)擴(kuò)增片段引物啟動(dòng)PCR幾個(gè)循環(huán)后再加入擴(kuò)增短片段的引物的方法避免,也可以通過(guò)降低擴(kuò)增短片段的引物來(lái)解決。理論上講,引物和基因靶序列的摩爾比至少為103:1,如此過(guò)量的引物才能確保模板DNA一且變性就與引物退火,而不是與其自身退火。一般引物量至少要10倍于模板量

(2)模板及模板濃度從血和新鮮組織中提取的DNA,濃度和質(zhì)量均能滿(mǎn)足多重PCR的要求。對(duì)于從菌體提取的DNA,為了減少樣品對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響,裂解液中加入的菌量不能太多否則會(huì)因裂解不完全,菌體蛋白抑制DNA聚合酶的活性,造成假陰性結(jié)果

要達(dá)到穩(wěn)定的結(jié)果,每個(gè)樣品都應(yīng)該測(cè)定濃度,實(shí)際工作中往往是抽樣檢測(cè)。所以,樣本模板濃度往往參差不齊,導(dǎo)致每個(gè)樣本擴(kuò)增效率不完全均等,有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增失敗的現(xiàn)象。此時(shí)要考慮模板的有效濃度,適當(dāng)加以調(diào)整。幾種不同來(lái)源的模板DNA的濃度為:哺乳動(dòng)物基因組DNA100g/ml;酵母基因組DNA1g/ml;細(xì)菌基因組DNA0.1pg/ml;質(zhì)粒DNA1~5ng/ml)dNTP和MgCl2的濃度dNTP和MgCl2是PCR反應(yīng)體系中的重要成分,因此對(duì)dNTP和MgC1的濃度進(jìn)行優(yōu)化也是很必要的

PCR反應(yīng)中一般用的dNTP和MgCl2的濃度分別為200m/L和1.5mmol/L。Mg2濃度在很大程度上影響擴(kuò)增的特異性,Mg2+一般正比于dNTP的濃度,這個(gè)比值確定好后可以在調(diào)整其它反應(yīng)條件時(shí)保持恒定。當(dāng)保持dNTP的濃度不變,隨著MgCl2濃度的升高,反應(yīng)的特異性逐漸增強(qiáng),但當(dāng)增加到一定程度后,反應(yīng)產(chǎn)物幾乎為零。PCR反應(yīng)中,dNTP和MgCl2的濃度應(yīng)該平衡,這可能是因?yàn)閐NTP能夠結(jié)合鎂離子,而 Taq DNA聚合酶發(fā)揮活性需要游離的鎂離子。另外,dNTP母液對(duì)于反復(fù)凍融十分敏感,反復(fù)凍融3~5次后,多重PCR反應(yīng)常常不能很好進(jìn)行,擴(kuò)增產(chǎn)物幾乎完全不可見(jiàn),但dNTP的這種低穩(wěn)定性在單一基因擴(kuò)增中并不明顯。

(4)PCR緩沖液(KCD的濃度如果多重PCR系統(tǒng)性地對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物有傾向性,最佳的選擇是設(shè)計(jì)一系列多重PCR實(shí)驗(yàn),固定Mg濃度(1.5mmo/L),依次遞增KCl的濃度(1.0~2.0倍),對(duì)每對(duì)引物進(jìn)行再優(yōu)化。相反,如果傾向于優(yōu)先擴(kuò)增較短的產(chǎn)物,則應(yīng)在保持KCl濃度不變的情況下逐步提高M(jìn)g2濃度(直至4.5mol/L)。如果所有產(chǎn)物的擴(kuò)增效率都很低試著提高模板和熱穩(wěn)定DNA聚合酶的濃度。如果沒(méi)有改善,則成倍增加所有引物的濃度并采用復(fù)性和延伸溫度依次降低2℃的降落PCR。

PCR緩沖液的濃度從1×提高到2×可以明顯提高多重PCR的效率,這種調(diào)節(jié)作用比調(diào)節(jié)DMSO、甘油或BSA更重要。通常產(chǎn)生長(zhǎng)片段擴(kuò)增產(chǎn)物的引物在低鹽濃度下擴(kuò)增結(jié)果更好,而生短片段擴(kuò)增產(chǎn)物的引物在高鹽濃度下擴(kuò)增結(jié)果更好,高鹽濃度會(huì)使長(zhǎng)片段擴(kuò)增產(chǎn)物難于變性解鏈

(5) Taq dNA聚合酶隨著多重PCR體系中引物對(duì)數(shù)目的增多,dNTP和聚合酶的量也要相應(yīng)增加。不同廠(chǎng)家的酶質(zhì)量也有差異,需要做濃度梯度實(shí)驗(yàn),尋找最佳的用酶量。使用過(guò)多的Tag dnA聚合酶會(huì)導(dǎo)致不同基因擴(kuò)增不平衡及背景的輕微增高,反應(yīng)的特異性降低?？梢栽?5反應(yīng)體積中加入2U,然后根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行輕微的調(diào)整

(6)輔助劑(如DMSO、甘油、BSA)的應(yīng)用在多重PCR反應(yīng)體系中加入50~100ml/的DMSO或甘油能夠提高多重?cái)U(kuò)增效率和敏感性,得到更多的擴(kuò)增產(chǎn)物和減少非特異擴(kuò)增。但是這些輔助劑可能會(huì)在另一方面干擾實(shí)驗(yàn)效果,因?yàn)樗鼘?duì)各基因位點(diǎn)擴(kuò)增效率的影響不同50ml/L的DMsO可能會(huì)提高某一位點(diǎn)的擴(kuò)增效率,降低另一位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量,而對(duì)某些位點(diǎn)則根本不產(chǎn)生影響;同理,DMSO可能抑制也可能是促進(jìn)非特異性擴(kuò)增。因而使用這些輔助劑的效果需要在每個(gè)具體的反應(yīng)體系中加以驗(yàn)證。加入適量的BSA(如L.0g/L)能顯著提高多重PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)候BSA效果要比DMSO和甘油好,但它的作用同樣也需要實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證

有些研究人員建議使用濃度范圍為5%~10%體積分?jǐn)?shù)的DMSO和甘油來(lái)改善擴(kuò)增的效率和特異性,但在多重反應(yīng)中,DMSO的使用會(huì)出現(xiàn)矛盾的結(jié)果。因此,DMSO和甘油的調(diào)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索。

2.反應(yīng)條件的優(yōu)化

由于在一個(gè)多重PCR反應(yīng)體系中有多對(duì)引物,而且擴(kuò)增的模板片段長(zhǎng)度也不盡相同,所以各對(duì)引物的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增速度也不相同。由于多重PCR反應(yīng)總是遵循較小片段優(yōu)先擴(kuò)增的原則,各對(duì)引物所要求最佳PCR條件也不盡相同(設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行多重PCR時(shí),應(yīng)使各引物所需PCR擴(kuò)增條件盡可能一致),因此在選擇多重PCR擴(kuò)增條件(尤其是退火溫度和時(shí)間)時(shí)應(yīng)盡量選擇有利于較大片段擴(kuò)增的條件

(1)退火時(shí)間和溫度在循環(huán)參數(shù)中,影響多重PCR擴(kuò)增效率的主要因素是復(fù)性溫度和延伸時(shí)間。復(fù)性溫度的設(shè)置策略與單個(gè)PCR相似。先計(jì)算引物的熔解溫度(Tm),在此基礎(chǔ)上推算復(fù)性溫度T。(T=T。-5)。然后用“逐步引人法”確定多重PCR的最佳T,即每增加一對(duì)引物,就根據(jù)擴(kuò)增的結(jié)果調(diào)整復(fù)性溫度,直至每一種被擴(kuò)增的基因片段都獲得滿(mǎn)意的效果。延伸時(shí)間是影響擴(kuò)增產(chǎn)量的重要因素。隨著擴(kuò)增的基因座數(shù)目的增加,延伸時(shí)間也應(yīng)延長(zhǎng)。在最佳的Mg2+和dNTP濃度范圍內(nèi)通過(guò)延長(zhǎng)延伸時(shí)間來(lái)提高擴(kuò)增產(chǎn)量,比單純?cè)黾覯g2+和dNTP濃度更為有效。

退火時(shí)間對(duì)擴(kuò)增效率的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于退火溫度的影響,將退火溫度降低4~6℃對(duì)于在多重PCR中擴(kuò)增出同樣的基因是必需的。多重反應(yīng)中并發(fā)的其它基因的特異擴(kuò)增會(huì)消除非特異擴(kuò)增的影響,同樣,擴(kuò)增效率高的基因會(huì)使擴(kuò)增效率低的基因的擴(kuò)增產(chǎn)量降低

(2)延伸溫度高的延伸溫度會(huì)減少某些基因的擴(kuò)增,即使用長(zhǎng)的退火時(shí)間和延伸時(shí)間也可能無(wú)法消除這種影響。

(3)延伸時(shí)間在多重PCR中,由于同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因,酶和dNTP的缺乏就成為限制因素,就需要更多的時(shí)間來(lái)完成所有產(chǎn)物的合成。多重PCR中增加延伸時(shí)間,可以增加較長(zhǎng)PCR產(chǎn)物的量。也有實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)延伸時(shí)間延長(zhǎng)時(shí),所有基因的PCR產(chǎn)物量都增加了

4)PCR循環(huán)數(shù)PCR產(chǎn)物量增加最明顯的是在25個(gè)循環(huán)附近。通常對(duì)于一個(gè)反應(yīng),2830個(gè)循環(huán)就足夠了,增加至60個(gè)循環(huán)對(duì)產(chǎn)物量無(wú)明顯影響

總之,多重PCR反應(yīng)條件的設(shè)置是一個(gè)棘手的問(wèn)題,也是多重PCR成功的保證。一般策略是首先進(jìn)行單個(gè)PCR反應(yīng),分別設(shè)定各引物對(duì)應(yīng)的條件;然后,依次增加引物對(duì),不斷調(diào)整反應(yīng)條件直至最后保證所有的引物對(duì)都能在同一條件下擴(kuò)增出目的條帶。

五、常見(jiàn)問(wèn)題的解決

針對(duì)多重PCR中的常見(jiàn)問(wèn)題,可以通過(guò)改變影響PCR擴(kuò)增效果的因素來(lái)解決

1.若所有產(chǎn)物條帶都很弱

①增加延伸時(shí)間;

②降低延伸溫度至62~68℃;

③逐步降低退火溫度;

④調(diào)整 Taq DNA聚合酶的濃度;

⑤同時(shí)應(yīng)用以上4種策略。

2.若短片段產(chǎn)物條帶較弱

①緩沖液濃度從1×增加至1.5×或2×;

②降低退火或延伸溫度;

③增加弱條帶相對(duì)應(yīng)的引物量;

④同時(shí)應(yīng)用以上3種策略。

3.若長(zhǎng)片段產(chǎn)物條帶較弱

①增加延伸時(shí)間;

②增加退火和/或延伸溫度

③增加弱條帶相對(duì)應(yīng)的引物濃度;

④降低緩沖液濃度至0.7×~0.8×,同時(shí)保持MgCl2濃度1.5~2mmol/1L不變;

⑤同時(shí)應(yīng)用以上4種策略

4.若出現(xiàn)非特異產(chǎn)物

①若非特異產(chǎn)物是長(zhǎng)片段,增加緩沖液濃度至1.4×~2.0×;

②若是短片段,降低緩沖液濃度至0.7×~0.9×;

③逐漸增加退火溫度

④減少模板和聚合酶的用量;

⑤增加Mg2至3mmol/L、6mmol/L、9mmol/L、12mmol/L-,同時(shí)保持dNTP濃度恒定在200umol/L:

⑥同時(shí)應(yīng)用以上5種策略

5.若以上方法都未見(jiàn)效,可以進(jìn)行以下嘗試

①加入輔助劑BSA(0.1~0.8pg/p);

②加入輔助劑DMsO或甘油(5%,體積分?jǐn)?shù));

③重新比對(duì)引物,確保引物之間不存在相互作用;

六、應(yīng)用

(一)多重PCR在遺傳病診斷方面的應(yīng)用

1.DMD和BMD的檢測(cè)

Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥( Duchenne muscular dystrophy,DMI)是一種很常見(jiàn)的人類(lèi)遺傳病,為X性染色體隱性遺傳性肌肉變性疾病,50%的病例由基因缺失引起,大約每3500個(gè)男嬰就有一個(gè)發(fā)病,1/3的病例由新的突變所致,肌營(yíng)養(yǎng)不良基因長(zhǎng)200kb,至少有70個(gè)外顯子,被35個(gè)平均35kb的內(nèi)含子所間隔1。目前尚無(wú)有效治療的方法,因而高度準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷和DMD陽(yáng)性篩選是十分重要的。以往多用 Southern分析技術(shù)來(lái)診斷,但由于該基因由多達(dá)70個(gè)外顯子,至少需要7~9個(gè)cDNA克隆才能診斷,費(fèi)用高、費(fèi)時(shí)而難以常規(guī)開(kāi)展。BMD是Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥( Becker muscular dystrophy)的縮寫(xiě)。BMD亦為X性染色體隱形遺傳性肌肉變性疾病。BMD的發(fā)病率為新生男嬰的三萬(wàn)分之一。65%的BMD病例的原因是基因缺失。

Chamberlain等利用多重PCR技術(shù)對(duì)DMD進(jìn)行了檢測(cè),設(shè)計(jì)了6對(duì)外顯子引物。用1umol/L引物加10UTaq酶,延伸溫度為?2℃3min,25個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物電泳后,如與正常對(duì)照的對(duì)應(yīng)條帶相比有缺失或移位,即為異常。隨后該實(shí)驗(yàn)室又將引物增加至9對(duì),使至少80%的DMD基因缺失得到確定,能直接診斷50%以上的病例。 Hentemann等2設(shè)計(jì)了2對(duì)產(chǎn)物分別為140bp和73bp的引物,對(duì)42例病人檢測(cè)后,發(fā)現(xiàn)7例基因缺失并經(jīng) Southern雜交分析證實(shí)。Simard等報(bào)道用 Chamberlain的引物對(duì)DMD進(jìn)行擴(kuò)增,并對(duì)DNA模板處理進(jìn)行了改進(jìn),用lm羊膜液離心后的細(xì)胞經(jīng)非離子去垢劑和蛋白酶K的PCR緩沖液裂解后直接PCR擴(kuò)增,效果令人滿(mǎn)意。由于 DMD/BMD是等位基因,近來(lái)的文獻(xiàn)多同時(shí)檢測(cè)此兩種疾病。Begs等用多重PCR同時(shí)檢測(cè)肌營(yíng)養(yǎng)不良基因的8個(gè)外顯子和啟動(dòng)子,可使98%有基因缺失的DMD/BMD獲得診斷。 Covone等人用兩種方法對(duì)照研究了127例DMD/BMID2一種方法是用與 DMD CDNA相關(guān)的9種cDNA探針與HindⅢ消化的基因族DNA雜交,另一種方法是用9對(duì)DMD外顯子的引物進(jìn)行多重PCR檢測(cè),結(jié)果73例(57%)存在基因缺失,兩組方法結(jié)果相近。我國(guó)華西醫(yī)科大學(xué)的學(xué)者亦用 Chamberlain的9對(duì)引物對(duì)17例DMD/MD病例進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果8例(47%)發(fā)現(xiàn)基因缺失,證明了針對(duì)西方人的引物序列同樣可以檢測(cè)中國(guó)病例。

2.用于其它遺傳病的檢測(cè)

Pici等人鵒對(duì)囊性纖維化( cystic fibrosis,CF)基因突變進(jìn)行了篩選研究,用4對(duì)外顯子引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,然后用限制性?xún)?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,再進(jìn)行垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳,檢查15例發(fā)現(xiàn)有3例發(fā)生了基因突變。Pior等設(shè)計(jì)了8對(duì)引物同時(shí)檢測(cè)DMD/BMD和CF,通過(guò)凝膠電泳篩選 DMD/ BMD缺失突變,并用等位基因特異的寡核苷酸雜交確定CF突變是否存在。實(shí)驗(yàn)表明,可以通過(guò)多重PCR的方法從血斑中獲得足夠的DNA進(jìn)行分子分析,可用于新生兒的篩選。 Pillers等人m用多重PCR和 Southern雜交方法研究了一位同時(shí)患AIED(Aland island eye disease)、甘油激酶缺乏(GKD)和DMD的病例,發(fā)現(xiàn)在DXS67(1 deoxy-D-xylulose5- phosphate synthase67)和DMD基因之間出現(xiàn)基因缺失。另外,還有用多重PCR方法篩查類(lèi)固醇硫酯酶( steroid sulfatase,,srs)缺乏癥和診斷β地中海貧血患者的報(bào)道。

脊髓性肌萎縮癥( spinal muscular atrophy,SMA)是一種常染色體隱性遺傳神經(jīng)性肌肉疾病。SMA會(huì)造成位于腦底和脊髓的下級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分裂,從而使其無(wú)法發(fā)出肌肉進(jìn)行正?；顒?dòng)所依賴(lài)的化學(xué)及電信號(hào)。SMA主要影響患者的近端肌,即最靠近人體軀干部的肌肉?？刂莆?、腸和膀胱等器官運(yùn)動(dòng)的非隨意肌不會(huì)受到影響。各型都會(huì)對(duì)控制隨意肌運(yùn)動(dòng)的叫作運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生影響。最近的基因研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡也許是因?yàn)槿鄙僖环N或幾種蛋白,或者是它們不能完全發(fā)揮其功能而導(dǎo)致的。 Simard等應(yīng)用多重實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR方法(muli Xplex real-time reverse transcriptase- PCR)對(duì)存活運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元( survival motor neuron,SMN)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量,共檢測(cè)了42個(gè)潛伏期SMA病人的血標(biāo)本,每個(gè)病人取三個(gè)時(shí)間點(diǎn),發(fā)現(xiàn)SMN的表達(dá)在每個(gè)病人的不同時(shí)間點(diǎn)上的轉(zhuǎn)錄是穩(wěn)定的, SMN mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)可以作為SMA臨床試驗(yàn)的生物標(biāo)志以作為SMA臨床試驗(yàn)的生物標(biāo)志

甘露糖結(jié)合素( mannose-binding lectin,MBu)是一種血清蛋白,能夠觸發(fā)補(bǔ)體激活,因此在先天性免疫中發(fā)揮重要作用。低水平的MBL會(huì)損傷病原微生物的調(diào)理作用,進(jìn)而導(dǎo)致兒童的反復(fù)感染、免疫受損病人的嚴(yán)重感染以及自身免疫疾病。MHBL的編碼基因位于人類(lèi)10q11.2~q21染色體,包括四個(gè)外顯子,血清中MBL水平受其啟動(dòng)子多態(tài)性和MB2基因第一個(gè)外顯子突變的影響。目前應(yīng)用的MBL基因分型方法主要有以下幾種:PCR限制酶切分析、序列特異寡核苷酸探針雜交( sequence-specific oligonucleotide probes,SsOP)、放大受阻突變體系( amplification refractory mutation system,ARMs)、ARMS聯(lián)合SSOP、異源雙鏈分析( heteroduplex analysis)、實(shí)時(shí)PCR以及應(yīng)用小溝結(jié)合DNA探針的5端核酸酶分析。 Helena0等建立了種快速、高效的多重PCR方法對(duì)MBL2基因進(jìn)行分型,并且將捷克人作為斯拉夫人的代表樣本,應(yīng)用此方法研究了MBI2的等位基因頻率。共分析了359個(gè)不相關(guān)捷克人的MBL2基因,最終得出LYD單元型在斯拉夫人的祖先中比其它高加索人更常見(jiàn),同時(shí)也證明了多重PCR是一種比傳統(tǒng)PCR方法更快速、簡(jiǎn)便、省時(shí)省力的MBI2分型方法。

根據(jù)當(dāng)前不育領(lǐng)域的研究,大約10%~15%的夫婦存在不育的問(wèn)題,而在所有的不育個(gè)體中,男性不育大約占50%,其中40%~50%存在精子缺陷,如少精癥和無(wú)精癥。人類(lèi)Y染色體的長(zhǎng)臂對(duì)于精子的產(chǎn)生是必需的。在三個(gè)不同區(qū)域的缺失會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的精子缺陷,包括非閉塞的無(wú)精子癥和精子減少癥。這些區(qū)域被稱(chēng)為無(wú)精子癥因子( azoospermia factor,AZF),三個(gè)分離的非重疊區(qū)被定義為AzFa、AZFb、AZFc,與產(chǎn)生人類(lèi)損傷的精子有關(guān)。近來(lái)的研究證明Yq染色體的微缺失會(huì)遺傳給其兒子。Yeom等應(yīng)用多重PCR擴(kuò)增6個(gè)位點(diǎn),包括Y染色體的性別決定區(qū)( sex-determining region on the Y chromosome,SRY)作為陽(yáng)性對(duì)照,無(wú)精子癥因子區(qū)域的5個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)( sequence-tagged site,Srs),其中模板是從不育男性血液中提取的基因組DNA。本研究中的引物為Cy3標(biāo)記,PCR產(chǎn)物可以與固定的探針雜交,提供了一種敏感、高通量檢測(cè)Y染色體缺失的方法,也是一種男性不育篩選的新方法。

(二)著床前胚胎遺傳學(xué)診斷( preimplantation genetic diagnosis,PGD)

PGD產(chǎn)生于10多年前,主要目的是識(shí)別基因突變或染色體錯(cuò)誤引起的遺傳性疾病。臨床上最早是用來(lái)檢測(cè)夫妻X隱形連鎖疾病,隨后應(yīng)用于不同的患者來(lái)達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的,主要包括:單基因病攜帶者,無(wú)論顯性或隱性、常染色體或X連鎖;染色體結(jié)構(gòu)異常攜帶者,包括易位、翻轉(zhuǎn)、缺失、插入等;避免高齡產(chǎn)婦后代染色體異常;輔助生殖治療反復(fù)植入失敗的夫婦反復(fù)出現(xiàn)不明原因流產(chǎn)的夫婦。當(dāng)前PGD已經(jīng)成為產(chǎn)前診斷( prenatal diagnosis)的一種替代方法。

對(duì)于單基因缺陷患者,可以用多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)位點(diǎn),選擇那些位于相同染色體或者臨近致病基因的多態(tài)性標(biāo)志位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增能夠有效診斷突變位點(diǎn)和多態(tài)性等位基因,可以同時(shí)分析多個(gè)診斷位點(diǎn),并且減少錯(cuò)誤診斷的概率。另外,還可以擴(kuò)增高變的指紋位點(diǎn),指示DNA模板是否被污染

囊性纖維化病( cystic fibrosis,CF)是一種首次成功應(yīng)用單細(xì)胞植入前基因診斷的單基因缺陷性疾病。CF的突變譜差別很大,因此,發(fā)展一種突變特異的PGD方法是行不通的。文獻(xiàn)[35]建立了一種針對(duì)CF通用的多重PCR方法,用于胚胎的遺傳學(xué)診斷。本研究應(yīng)用了CF跨膜調(diào)控子( cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR)兩側(cè)的4個(gè)緊密連鎖高多態(tài)性重復(fù)標(biāo)識(shí):D7S523、D7S486、DS480和D7S90。共檢測(cè)了100個(gè)白細(xì)胞和50個(gè)卵裂球,其中99%6獲得了多重PCR結(jié)果,總體等位基因遺失( allelic drop out,ADO)頻率從2%~5%不等。確認(rèn)ADO以及額外等位基因存在后,95%的多重PCR結(jié)果可以用來(lái)建立基因型標(biāo)記。基于父母的基因型,考慮到由于變異參數(shù)(5%、ADO(0~2%)和單重組(1.1%~3%)造成的胚胎傳送丟失,大約90%的胚胎能夠應(yīng)用單個(gè)卵裂球進(jìn)行可靠的PGD基因分型。錯(cuò)誤診斷的概率與已知的兩側(cè)標(biāo)識(shí)雙重組概率相當(dāng),小于0.05%。因此,這種多態(tài)性和多等位基因標(biāo)識(shí)系統(tǒng)是一種可靠的、可替代直接突變胚胎遺傳學(xué)診斷的方法。

(三)在遺傳修飾生物( genetically modified organisms,GMO)中的應(yīng)用

近年來(lái)可見(jiàn)應(yīng)用多重PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分定性和定量檢測(cè)的報(bào)道。陳文炳等用多重PCR方法在反應(yīng)體系中加入13對(duì)引物同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因矮牽牛與陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒中的1~3個(gè)外源基因,包括花榔菜花葉病毒( cauliflower mosaic virus, CaMV)35S啟動(dòng)子、根瘤農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因終止子(NOS)、大腸桿菌K12菌株新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(NptⅡ)編碼基因。結(jié)果表明,多重PCR不但可以提高檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本,還可以有效防止假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)

四)基因重排

免疫球蛋白( immunoglobulin,Ig)和T細(xì)胞受體( T cell receptor,TCR)位點(diǎn)包含很多不同的V、D、J基因片段,參與早期白細(xì)胞分化的重排過(guò)程。VDJ片段重排由重組酶復(fù)合體介導(dǎo),其中RAG1和RAG2蛋白通過(guò)識(shí)別、切割DNA重組信號(hào)序列( recombination signal sequences,RSs)發(fā)揮重要作用,RSS位于V基因下游、D基因兩端和J基因上游。不合適的RSS會(huì)降低甚至完全阻止重排。 van dongen等成功建立了一種多重PCR方法并將其標(biāo)準(zhǔn)化,能夠檢測(cè)同源細(xì)胞重排免疫球蛋白和T細(xì)胞受體基因、染色體畸變t(11;14)和t(14;18)。在18個(gè)多重FCR反應(yīng)中,可以使用107對(duì)不同的引物進(jìn)行擴(kuò)增。14個(gè)Ig/TCR和4個(gè)BCL/BCL2多重反應(yīng)體系證明了多重PCR反應(yīng)完全適合淋巴增生缺陷的克隆研究,并且具有較高的敏感性。特別是在疑似B細(xì)胞增殖中與IGH和IGK聯(lián)合應(yīng)用,疑似T細(xì)胞增殖中與TCRB和TCRG聯(lián)合應(yīng)用具有極高的克隆檢出率

(五)抗性基因檢測(cè)

抗生素的廣泛使用導(dǎo)致具有耐藥性微生物的增多,比如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌( methi-cillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、萬(wàn)古霉素抗性腸球菌( vancomycin resistant enterococcl)和多重耐藥結(jié)核分枝桿菌( multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis)等。這些病原的快速檢測(cè)及對(duì)應(yīng)的抗生素抗性快速檢測(cè)對(duì)于隔離病人和阻止疾病的進(jìn)一步蔓延是很重要的。多重PCR方法能夠?qū)@些抗生素抗性基因進(jìn)行同時(shí)檢測(cè),節(jié)省時(shí)間,具有較高的敏感性和特異性。

Strohmenger等應(yīng)用多重PCR方法同時(shí)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的9種耐藥基因,包括mecA、aacA~anhD、tetK、tetM、emA、emC、wtA、wtB和wC,并且在反應(yīng)中加入另外對(duì)引物,擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的16 SrRNA作為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)對(duì)分離的3株金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè),多重PCR結(jié)果與肉湯微量稀釋實(shí)驗(yàn)得到的抗性表型一致,證明了多重FCR是一種識(shí)別抗生素抗性的快速、簡(jiǎn)便、精確方法,并且可以用于臨床診斷、流行病學(xué)研究中用于監(jiān)測(cè)抗性基因的傳播還可用多重PCR方法同時(shí)檢測(cè)質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮抗性基因qmA、qrB和qnrS,并用來(lái)篩選科威特分離的64株產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶( expanded- spectrum beta-lactamase,ESBL)的腸細(xì)菌。