相對(duì)速度快并且占用內(nèi)存小的TopHat在RNA-Seq中常常用于跨內(nèi)含子比對(duì)，這里我們來(lái)關(guān)注一下TopHat2，TopHat2的安裝是依賴Bowtie2的（當(dāng)然Bowtie1也是可行的），TopHat2適合于75bp以上Read的比對(duì)。TopHat2是一個(gè)多步驟比對(duì)的程序，如果基因組的注釋文件存在的話，那么它會(huì)先將Read比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組上。這就大大提高了比對(duì)的準(zhǔn)確性，還可以避免序列匹配到假基因上，加快了整個(gè)比對(duì)的進(jìn)程。TopHat2容錯(cuò)率很低，并不會(huì)因?yàn)闆](méi)有比對(duì)上就而截短Read從而去比對(duì)上，所以低質(zhì)量的堿基比對(duì)的效果可能不是那么好。此外，TopHat2可以察覺(jué)基因組的易位，將Read比對(duì)到潛在的融合轉(zhuǎn)錄子上。

TopHat2比對(duì)有三個(gè)主要的過(guò)程，轉(zhuǎn)錄組的比對(duì)（步驟一），基因組的比對(duì)（步驟二），剪接比對(duì)（步驟三到六，如圖4.1顯示的一樣），雙端測(cè)序的Read首先每端數(shù)據(jù)要分別單獨(dú)進(jìn)行比對(duì)，然后考慮比對(duì)的片段長(zhǎng)度以及方向?qū)为?dú)比對(duì)結(jié)果合并在一起形成雙端比對(duì)結(jié)果。

圖4.1Tophat2剪接比對(duì)的程序

（a）那些沒(méi)有比對(duì)到基因組或者轉(zhuǎn)錄組的Read將會(huì)片段化，形成更小的片段，并且再一次比對(duì)到基因組上，如果TopHat2發(fā)現(xiàn)Read片段化后的左右兩個(gè)片段的位于用戶定義的最大內(nèi)含子長(zhǎng)度范圍內(nèi)，TopHat2就會(huì)將Read映射到整個(gè)基因組的區(qū)域以便于去尋找那些含有剪接信號(hào)的剪接位點(diǎn)（b）潛在的剪接位點(diǎn)側(cè)翼基因組序列被串聯(lián)起來(lái)，并構(gòu)建索引，未映射的Read片段（在這里由星號(hào)標(biāo)記）用Bowtie2比對(duì)串聯(lián)的側(cè)翼區(qū)域。（c）被分割的片段重新連接形成完整的Read。

1. 如果注釋信息是已知的，那么TopHat2就會(huì)將Read比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組上，它是通過(guò)一個(gè)GTF或是GFF格式的文件從bowtie2建立的索引文件里提取轉(zhuǎn)錄本序列。

2. 沒(méi)有完全比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組的Read再次通過(guò)Bowtie2比對(duì)到基因組，在這一階段，那些能夠連續(xù)比對(duì)到單一外顯子的Read將會(huì)映射到基因組上，而比對(duì)到多個(gè)外顯子的Read將不會(huì)映射到基因組上。

3. 那些沒(méi)有被映射上的Read將會(huì)被片段化，通常默認(rèn)大小為25bp，之后再次比對(duì)到基因組上，如果TopHat2發(fā)現(xiàn)左右的片段化的Read映射到自定義的最大內(nèi)含子區(qū)長(zhǎng)度內(nèi)，TopHat2就會(huì)將Read映射到整個(gè)基因組的區(qū)域以便于去尋找那些含有剪接信號(hào)（GT-AG, GC-AG, or AT-AC)）的剪接位點(diǎn)，TopHat2在這一步也能用于尋找缺失以及融合轉(zhuǎn)錄子。

4.潛在的剪接位點(diǎn)的側(cè)翼基因組序列被串聯(lián)起來(lái)，并構(gòu)建索引，未映射的Read片段用Bowtie2比再次比對(duì)串聯(lián)的側(cè)翼序列。

5. 將步驟3和步驟4的小片段拼接在一起完成整個(gè)Read的比對(duì)。

6. 在步驟2中Read有一部分堿基比對(duì)到內(nèi)含子的將會(huì)用新的剪接位點(diǎn)的信息進(jìn)行重新比對(duì)。

7. 在多重比對(duì)中為了確定哪一個(gè)位置比對(duì)是最合適的，TopHat2將會(huì)依據(jù)匹配到剪接位點(diǎn)的或者indel的Read數(shù)量信息重新判分以選擇最優(yōu)的比對(duì)。

構(gòu)建索引

如果你想使用TopHat2，那么你就要像前文描述Bowtie2一樣建立基因組的索引，TopHat2一樣需要相應(yīng)的基因組的FASTA格式的文件，所以索引建立好后用不著刪除，如果FASTA格式的基因組不與索引在同一個(gè)文件夾下，那么Tophat2在運(yùn)行過(guò)程中就會(huì)自動(dòng)生成，所以TopHat2的使用是一個(gè)高耗時(shí)的。

如果GTF或是GFF格式的基因組注釋文件存在的話，那么讀長(zhǎng)將會(huì)優(yōu)先比對(duì)到注釋文件的轉(zhuǎn)錄組，GTF的文件可在http://www./info/data/ftp/index.html網(wǎng)站找到，選擇對(duì)應(yīng)的生物和GTF選項(xiàng)即可。

如果可行的話，應(yīng)該事先準(zhǔn)備好轉(zhuǎn)錄組索引以節(jié)約后續(xù)比對(duì)的時(shí)間。

tophat2 -G GRCh37.74.gtf --transcriptome-index= GRCh37.74.tr GRCh37.74

在這里我們使用了注釋文件GRCh37.74.gtf和Bowtie2生成的基因組索引GRCh37.74來(lái)建立名為GRCh37.74.tr轉(zhuǎn)錄組索引，這里需要注意的是，基因組索引里染色體的名稱一定要和GTF文件里的相同。在這里Bowtie2生成的基因組索引文件必須用到，所以TopHat2的使用是依賴于Bowtie2的。運(yùn)行完畢后，生成的文件如：

GRCh37.74.tr.1.bt2

GRCh37.74.tr.2.bt2

GRCh37.74.tr.3.bt2

GRCh37.74.tr.4.bt2

GRCh37.74.tr.fa

GRCh37.74.tr.fa.tlst

GRCh37.74.tr.gff

GRCh37.74.tr.rev.1.bt2

GRCh37.74.tr.rev.2.bt2

GRCh37.74.tr.ver

比對(duì)Read

FASTA和FASTQ類(lèi)型的文件都可以作為T(mén)opHat2的輸入文件，.gz結(jié)尾壓縮的Read是可以直接使用的，但是.tgz 或者 .tar.gz結(jié)尾的壓縮文件是需要被解壓后才能使用。下面的例子分別展示對(duì)了單端測(cè)序和雙端測(cè)序的序列比對(duì)的命令，如果有必要的話，Tophat2也可以將單端測(cè)序的Read用于雙端測(cè)序Read的比對(duì)中。

下面兩個(gè)命令都可以作為單端比對(duì)方式，在例子中，序列被比對(duì)到人類(lèi)參考基因組（GRCh37.74），但是第一個(gè)命令用了先前就有的轉(zhuǎn)錄組的索引，而第二個(gè)命令的索引則是在執(zhí)行過(guò)程中生成的。

tophat2 -o outputFolder --transcriptomeindex=GRCh37.74.tr -p 8 --phred64-quals GRCh37.74 reads1.fastq.gz

tophat2 -o outputFolder -G GRCh37.74.gtf -p 8 --phred64-quals GRCh37.74 reads1.fastq.gz

如果是近些年測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，那么TopHat2則默認(rèn)堿基質(zhì)量得分為質(zhì)量字符的ASCII值-33，但是如果測(cè)序較早，則應(yīng)該使用參數(shù)（--phred64-quals），則堿基質(zhì)量得分為質(zhì)量字符的ASCII值-64，參數(shù)（-p 8）可以設(shè)置8個(gè)線程加快比對(duì)速度。此外TopHat2處理鏈特異性測(cè)序數(shù)據(jù)，一般Illumina數(shù)據(jù)的默認(rèn)library-type為fr-unstranded。TopHat2還有許多比對(duì)時(shí)可以使用的參數(shù)，參數(shù)（-T）使得Read僅比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組上，或者通過(guò)參數(shù)（-g）改變每個(gè)Read最大比對(duì)到參考基因組的次數(shù)，一般情況默認(rèn)是20次。

The align_summary.txt 顯示了 79.3% 的Read映射上了:

Reads:

Input : 34232081

Mapped : 27140089(79.3% of input)

of these: 1612317 (5.9%)have multiple

alignments (2771 have >20)

79.3% overall read mapping rate.

雙端測(cè)序的序列比對(duì)的方式如下，需要注意的是兩個(gè)文件的Read的順序應(yīng)當(dāng)一致以保證TopHat2的正常運(yùn)行。如果有多個(gè)文件，那么僅需要用逗號(hào)將按順序?qū)⑽募糸_(kāi)就行。

tophat2 –o outputFolder ––transcriptomeindex=GRCh37.74.tr –p 8 --phred64-quals GRCh37.74 reads1.fastq.gz reads2.fastq.gz

TopHat2有些參數(shù)特意針對(duì)應(yīng)用雙端測(cè)序得到的序列的比對(duì)，，參數(shù)（-r）可以依據(jù)你的數(shù)據(jù)設(shè)置需要的兩比對(duì)末端的距離，通常默認(rèn)是50（樣品的插入片段大小為200bp，讀長(zhǎng)一般為75bp，200-2*75=50，譯者注目前大多數(shù)為雙端150bp），參數(shù)(--no-discordant)可以對(duì)于成對(duì)的Read，并且只報(bào)告方向以及插入片段一致的映射；如果Tophat2不能將成對(duì)Read一塊映射到基因組，那么默認(rèn)條件下它將單獨(dú)映射相應(yīng)的Read，參數(shù)（--no-mixed）可以改變這一默認(rèn)條件。

Left reads:

Input : 34232081

Mapped : 27143093(79.3% of input)

of these: 1014796 (3.7%)have multiple

alignments (3621 have >20)

Right reads:

Input : 34232081

Mapped : 22600062 (66.0% of input)

of these: 759539 (3.4%)have multiple

alignments (3193 have >20)

72.7% overall read mapping rate.

Aligned pairs: 21229613

of these: 702920 (3.3%)have multiple alignments

336032 (1.6%)are discordant alignments

61.0% concordant pair alignment rate.

TopHat2可以產(chǎn)生多個(gè)輸出文件

accepted_hits.bam 以BAM文件的形式儲(chǔ)存著比對(duì)信息，這些比對(duì)信息是依據(jù)染色體的順序排列儲(chǔ)存的。

junctions.bed 是以Bed格式儲(chǔ)存著發(fā)現(xiàn)的剪接位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)都含有左右兩個(gè)部分，每個(gè)部分長(zhǎng)度是Read能夠跨越剪接位點(diǎn)匹配到基因組的最遠(yuǎn)距離，最終的得分是跨越剪接位點(diǎn)的Read數(shù)量。

insertions.bed 包含著查詢到的插入位點(diǎn)信息，chromLeft指的是插入到基因組的位置。

deletions.bed 包含著查詢到的缺失位點(diǎn)信息，chromLeft指的是缺失片段的第一個(gè)堿基。

align_summary.txt能夠顯示比對(duì)效率以及多少Read能夠多處比對(duì)。