lncRNA之所以在科研界炙手可熱，是因為它有通天徹地之能，DNA、RNA、蛋白質(zhì)均與它有著千絲萬縷的關(guān)系，可介導(dǎo)胞內(nèi)各種各樣的生物學(xué)效應(yīng)。lncRNA如此全能，甚至可媲美蛋白質(zhì)，因而要研究lncRNA，一招移花接木，靈活套用蛋白研究思路，自然可以一步登天。

眾所周知，lncRNA對基因的調(diào)控可發(fā)生在基因水平、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后這5個環(huán)節(jié)。而細分下來，這5個環(huán)節(jié)共包含了12種能夠影響基因表達調(diào)控與功能的途徑：

基因水平

1）lncRNA參與調(diào)節(jié)DNA甲基化，甲基化需要蛋白酶催化，lncRNA可以起到穿針引線的作用。

轉(zhuǎn)錄水平

2）&3）：lncRNA對轉(zhuǎn)錄因子以及其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的作用主要有兩種：招募（recruitment）和抑制（inhibitor），需要依據(jù)具體情況來分析促進或抑制轉(zhuǎn)錄過程。

4）lncRNA轉(zhuǎn)錄后直接結(jié)合附近的DNA序列，抑制轉(zhuǎn)錄。該過程的特殊之處在于不依賴于蛋白，是核酸之間直接結(jié)合。

5）lncRNA可影響轉(zhuǎn)錄復(fù)合物以及RNA聚合酶的催化活性，進而影響轉(zhuǎn)錄過程。

6）lncRNA影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的組蛋白修飾包括甲基化、乙?；?，進而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程。

轉(zhuǎn)錄后水平

7）lncRNA可結(jié)合mRNA影響可變剪切，即影響mRNA的前體加工成熟的過程。

8）mRNA加工成熟后需要轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)進行蛋白翻譯，而mRNA的定位也會受到lncRNA影響。

9）mRNA的穩(wěn)定性同樣受到lncRNA調(diào)節(jié)。既可結(jié)合mRNA的3’UTR誘導(dǎo)mRNA降解（類似miRNA），也可結(jié)合蛋白，再靶向結(jié)合mRNA的序列，促進mRNA的穩(wěn)定性。

翻譯水平

10）lncRNA可以結(jié)合mRNA的5’UTR非翻譯區(qū)，促進翻譯過程；也可以結(jié)合特定的蛋白靶向mRNA，抑制翻譯。

翻譯后水平

11）lncRNA可調(diào)控蛋白翻譯后修飾，比如可影響JAK-STAT信號通路的明星分子STAT3的磷酸化水平。

12）lncRNA還能調(diào)節(jié)蛋白的細胞定位，進而影響蛋白的功能。

而依據(jù)分子作用的特點可對lncRNA作用機制進行進一步的濃縮簡化，并提煉總結(jié)為signal，decoy，guide，scaffold四種模式。

1）signal：信號分子。相比于蛋白，lncRNA的調(diào)控效率顯然要高。因為蛋白需要在編碼翻譯后，從胞漿再運送到細胞核內(nèi)，才能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控；而lncRNA（如反義lncRNA、eRNA）轉(zhuǎn)錄出來后可以直接結(jié)合染色體中鄰近位置的DNA調(diào)節(jié)基因表達，即順式調(diào)控模式（cis-regulation）。

2）decoy：誘騙。上策所講的ceRNA就是lncRNA發(fā)揮decoy作用的典型，屬于RNA-RNA直接結(jié)合的decoy。lncRNA也可以decoy蛋白，比如可競爭性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，抑制DNA的轉(zhuǎn)錄過程。

3）guide：引導(dǎo)。類似伴侶分子，在RNA-蛋白-DNA三元機制模式中，lncRNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子后，可將該轉(zhuǎn)錄因子定位至特定的DNA上，從而調(diào)控下游分子的轉(zhuǎn)錄。Guide屬于典型的反式調(diào)節(jié)作用（rans-regulation），因為lncRNA調(diào)控的是另外一個位置的基因。

而一般認為當(dāng)lncRNA對100萬堿基對距離（可人為縮小為20萬或50萬）之內(nèi)的基因進行調(diào)控作用時，則屬于cis調(diào)節(jié)。其實，signal和guide跟順式反式并非有著絕對的對應(yīng)關(guān)系。順式、反式只看位置遠近，signal、decoy、guide只看作用的特點。

4）scaffold：結(jié)構(gòu)骨架，指的是一個lncRNA充當(dāng)?shù)鞍讖?fù)合體的骨架，連接多個蛋白，歸屬于RNA和蛋白結(jié)合的范疇。Scaffold、guide、decoy均可以結(jié)合蛋白，其區(qū)別在于經(jīng)典的Guide模式可以連接DNA，而scaffold沒有結(jié)合DNA的戲，只結(jié)合蛋白；decoy競爭的蛋白，它本來是有一個其他的結(jié)合對象的，而scaffold模式中沒有。

通常lncRNA作用機制的基本模式有兩種：1）跟RNA交互以ceRNA為主流，2）找lncRNA的互作蛋白，一般lncRNA可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游靶基因的啟動子，構(gòu)成RNA-蛋白-DNA的三元結(jié)合。

其中，RNA蛋白結(jié)合是目前l(fā)ncRNA研究的重要機制方向，而且是高分文章的標(biāo)配。而針對RNA-蛋白分子交互作用的兩種不同情況可采用不同的實驗方法。

1）從已知lncRNA找結(jié)合蛋白的實驗方法主要是RNA pulldown，類似GST-pulldown，用帶有生物素biotin的RNA探針來捕獲lncRNA，然后用鏈霉親和素（Streptavidin）的beads結(jié)合biotin，如此親和層析后，換溶液洗脫下來的蛋白，可用質(zhì)譜鑒定或WB驗證。

2）而從已知蛋白找lncRNA的實驗方法則是RIP，類似ChIP，用ProteinA的beads偶聯(lián)抗體，抗體結(jié)合蛋白，蛋白把RNA沉淀下來，然后以測序/基因芯片高通量進行篩選，或用定量PCR進行驗證。

而近年來，研究RNA蛋白結(jié)合的改進新方法也是層出不窮，如CLIP、ChIRP、CHART，它們的基本原理都是一樣的：用生物素標(biāo)記RNA，然后捕獲蛋白，用測序分析RNA或質(zhì)譜分析蛋白。

如果蛋白和RNA兩個分子都已經(jīng)鎖定，驗證彼此結(jié)合也可以用另一種常用的核酸與蛋白相互作用的研究方法：凝膠遷移實驗（EMSA），該實驗最初被用于驗證轉(zhuǎn)錄因子與DNA相互作用。

此外，還可用蛋白芯片技術(shù)研究RNA-蛋白交互作用。通常一款蛋白組芯片上預(yù)制有大概2萬種人全長蛋白質(zhì)，只需要把lncRNA用化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄方法獲取純化出來，熒光標(biāo)記后與芯片孵育雜交，而后分析芯片上哪個位置蛋白結(jié)合探針有熒光信號，就可以識別lncRNA的結(jié)合蛋白。如果是研究蛋白-蛋白相互作用，就加入標(biāo)記的蛋白樣品進行雜交，原理一樣。

蛋白芯片已成為商業(yè)化的產(chǎn)品，好處是有公司服務(wù)，只要有l(wèi)ncRNA序列外包全套都能做下來，費用也還好。但是它是一種純粹體外的結(jié)合體系，跟胞內(nèi)情況可能會有不同，所以存在假陽性結(jié)果?；诖耍谕ㄟ^芯片找到互作分子后，仍需要提供經(jīng)典實驗（RIP、RNA-pulldown）的數(shù)據(jù)。

在此，推薦一個專門用來分析和計算蛋白與ncRNAs相互結(jié)合能力的數(shù)據(jù)庫catRAPID，它可根據(jù)二級結(jié)構(gòu)、氫鍵、范德華力等參數(shù)來預(yù)測蛋白-RNA的結(jié)合關(guān)系。

在catRAPID的模塊中，catRAPID omics應(yīng)該首先會用到。Omics可用于預(yù)測某一個lncRNA的結(jié)合蛋白，或者某一個蛋白的結(jié)合lncRNA，即只需知道lncRNA的核苷酸序列或蛋白氨基酸序列就可以了，circRNA也可以做。這個網(wǎng)站的其它模塊主要是確定了特定的lncRNA和特定蛋白組合之后，來進行進一步分析評估兩者間相互結(jié)合的效能。

目前大部分lncRNA的文章（包括circRNA）都是以篩選結(jié)果為起點的，并把經(jīng)篩選確認了表達差異以及細胞定位的lncRNA分子，進行一正一反的功能驗證以及細胞動物的二次驗證。

接下來若只研究間接機制，找明星通路和明星蛋白進行二元或三元論證即可；而要做直接作用機制研究，則首先應(yīng)確定該lncRNA的轉(zhuǎn)錄位置和亞細胞定位。

1）lncRNA定位于核內(nèi)，先考慮附近的基因有沒有表達受影響——signal模式?；诟咄繙y序的數(shù)據(jù)，分析lncRNA表達譜和mRNA表達譜的相關(guān)性，尋找順式調(diào)控作用。

如果順式作用無結(jié)果，可考慮反式作用調(diào)控基因。此時位置沒有限制了，關(guān)鍵需要找結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，套的是guide或者decoy的模式，研究蛋白-RNA相互作用（DNA甲基化酶、組蛋白、RNA聚合酶），根據(jù)RNA pulldown篩到的蛋白來具體展開。

2）lncRNA定位于胞漿，可以優(yōu)先考慮ceRNA，不然就要考慮lncRNA結(jié)合蛋白的作用機制，或者考慮mRNA結(jié)合影響穩(wěn)定性、可變剪切、調(diào)節(jié)翻譯、介導(dǎo)翻譯后修飾等角度。但不管是scaffold，guide還是decoy，研究RNA結(jié)合蛋白的實驗方法從篩選到驗證都一樣。

綜上，要想通過lncRNA、circRNA這些創(chuàng)新的分子類型，沖擊高分文章，本策移花接木就值得各位學(xué)員反復(fù)品味。下策“陽奉陰違”將細述mRNA可變剪切的研究套路，敬請期待。