蛋白質(zhì)濃度測定的方法有很多，考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)是實(shí)驗(yàn)室最常見的一種方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作簡便，下文介紹了考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)濃度的原理、優(yōu)缺點(diǎn)、操作以及注意事項(xiàng)。

實(shí)驗(yàn)原理

考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue)法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm變?yōu)?595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。通過測定595 nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。

考馬斯亮藍(lán)染色法的突出優(yōu)點(diǎn)是：

(1)靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1 mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。

(2)測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。

(3)干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K⁺、Na⁺、Mg²⁺離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。

此法的缺點(diǎn)是：

(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。

(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。

試劑與器材

一、試劑

考馬斯亮藍(lán)試劑：

考馬斯亮藍(lán)G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000 mL。

二、標(biāo)準(zhǔn)和待測蛋白質(zhì)溶液

1.  標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液

結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL蛋白溶液。

2.  待測蛋白質(zhì)溶液。

人血清，使用前用0.15 mol/L NaCl稀釋200倍。

三、器材

試管1.5×15 cm(×6)，試管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒溫水浴;分光光度計(jì)。

操作方法

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取7支試管，按下表平行操作。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A₅₉₅ nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

二、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測定

測定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的A₅₉₅ nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)。

注意事項(xiàng)

在試劑加入后的5-20 min內(nèi)測定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。

測定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，測定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。

利用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白必須要掌握好分光光度計(jì)的正確使用，重復(fù)測定吸光度時(shí)，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品最好是從低濃度到高濃度測定，防止誤差。