套路套路，大家講起套路來(lái)都是又愛(ài)又恨，簡(jiǎn)單的套路分?jǐn)?shù)低，分高的套路實(shí)驗(yàn)多。

分子實(shí)驗(yàn)-細(xì)胞實(shí)驗(yàn)-動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一套做下來(lái)，整個(gè)人都老了十歲！而做臨床的小伙伴心就更累了，我一做臨床的，天天去實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)真心...吃不消...啊

有沒(méi)有一個(gè)實(shí)驗(yàn)做得少，但又能發(fā)高分文章的思路呢?

那小編這里就教給大家一個(gè)省了好多實(shí)驗(yàn)還能發(fā)高分文章的套路，就是芯片分析or RNA-seq 、qpcr驗(yàn)證與高級(jí)生信分析再加簡(jiǎn)單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（完全不做實(shí)驗(yàn)還能發(fā)高分，臣妾做不到?。。??？梢哉f(shuō)這個(gè)套路能夠充分發(fā)揮臨床醫(yī)生的優(yōu)勢(shì)，讓臨床醫(yī)生可以專注于臨床數(shù)據(jù)挖掘，只做簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)就能發(fā)10分以上文章，so貼心了！

無(wú)文章無(wú)真相！接下來(lái)通過(guò)解讀一篇18年發(fā)表在nuture communications上的文章來(lái)講一講作者是怎么利用臨床優(yōu)勢(shì)（較易獲取臨床樣本）服務(wù)于臨床，“順便”拿12分的。

文章的題目是：A serum microRNA signature predicts trastuzumab benefit in HER2-positive metastatic breast cancer patients。

標(biāo)題概括所有，一看就知道是講預(yù)后分子分型了。

1. 曲妥珠單抗是HER2陽(yáng)性乳腺癌(HER2 )的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但對(duì)20-30%接受治療的患者無(wú)效。

2. 然而曲妥珠單抗是需要長(zhǎng)時(shí)間給藥的最昂貴的治療方案之一。因此迫切需要在治療前確定患者是否能從曲妥珠單抗治療中獲益。

3.越來(lái)越多的研究證明，特別的miRNA可作為腫瘤的生物標(biāo)記物預(yù)測(cè)各種腫瘤類型的預(yù)后及治療效果。然而，血清miRNA是否可以預(yù)測(cè)癌癥患者靶向治療的治療效果尚不清楚。

研究者通過(guò)分析miRNA芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在HER2 MBC patients 中，有13個(gè)差異miRNA對(duì)曲妥珠單抗有明顯的應(yīng)答反應(yīng)，并用lasso模型挑出其中的4個(gè)miRNA作為預(yù)測(cè)生存的標(biāo)志物，這4種miRNA都可直接作用于在曲妥珠單抗耐藥性調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的信號(hào)分子。

總之，研究者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可用于預(yù)測(cè)曲妥單抗對(duì)HER2 MBC patients治療效果好壞的模型，當(dāng)然，此模型還需要在前瞻性臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

研究者從254例樣本中挑取103例樣本作為訓(xùn)練集，其中包含61例應(yīng)答患者和42例未應(yīng)答者。研究者首先從miRNA數(shù)據(jù)挑取了13個(gè)差異miRNA(3個(gè)下調(diào)，10個(gè)上調(diào))，并對(duì)這13個(gè)miRNA做了qRT-PCR和相關(guān)性分析。然后運(yùn)用LASSO Cox regression model從中篩選得到4個(gè)marker及風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算公式。

同時(shí)，研究者還比較了4個(gè)miRNA在3組樣本（55 healthy volunteer donors, 134 trastuzumab-resistant patients, and 252 trastuzumab-sensitive patients）中的表達(dá)情況。

圖1  構(gòu)建基于4個(gè)miRNA的模型

為了驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算公式的準(zhǔn)確性和適用性，研究者除了對(duì)訓(xùn)練集，還用測(cè)試集和獨(dú)立驗(yàn)證集做了驗(yàn)證。

依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算公式計(jì)算出每個(gè)數(shù)據(jù)集中各樣本的風(fēng)險(xiǎn)得分，用X-tile軟件將每個(gè)數(shù)據(jù)集的樣本分成高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組，然后根據(jù)樣本的PFS和OS，做了Waterfall plots、survival等分析，證明挑取的miRNA和公式具有普適性，可作為marker使用。

圖2 風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算公式驗(yàn)證

研究者根據(jù)測(cè)試集和驗(yàn)證集的283例樣本的OS和PFS，做了單多因素分析。單因素分析結(jié)果表明：每個(gè)miRNA都可作為HER2 MBC patients的獨(dú)立預(yù)后因子。多因素分析結(jié)果表明：4-miRNA signature 和 themetastatic sites可作為獨(dú)立預(yù)后因子。

圖3  單、多變量cox回歸分析

根據(jù)個(gè)別的臨床病理特征（metastatic sites, age, Ki67, ECOG, ER status, PR status,and menopause等）進(jìn)行分層，挑取的4個(gè)marker在預(yù)測(cè)HER2 MBC patients的PFS時(shí)，在不依賴于臨床病理特征的同時(shí)，仍可作為一個(gè)具有臨床和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的模型。

圖4 PFS森林圖

為了進(jìn)一步驗(yàn)證marker在風(fēng)險(xiǎn)得分預(yù)測(cè)方面的效果，研究者又根據(jù)3個(gè)數(shù)據(jù)集的OS信息，做了Time-dependent ROC分析。結(jié)果表明，挑取的marker是一個(gè)穩(wěn)定的模型。同時(shí)，研究者也比較了4個(gè)miRNA和部分臨床指標(biāo)的準(zhǔn)確性。

圖5 ROC分析曲線圖

最后，研究者對(duì)4個(gè)marker的預(yù)測(cè)價(jià)值、來(lái)源和機(jī)制做了相關(guān)研究。這一部分算是比較常規(guī)的生信分析與實(shí)驗(yàn)步驟。研究者分離了原發(fā)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞，培養(yǎng)之后進(jìn)行了體外細(xì)胞增殖凋亡測(cè)定；并分離了細(xì)胞外囊泡做了Western印跡分析。

圖6 Kaplan-Meier生存分析

圖7 4個(gè)marker的起源

其實(shí)這篇文章的亮點(diǎn)就在于它有大量的臨床樣本（對(duì)于臨床醫(yī)生來(lái)說(shuō)，相對(duì)較易獲?。?，加上臨床數(shù)據(jù)挖掘與機(jī)器學(xué)習(xí)，構(gòu)建了一個(gè)可用于預(yù)測(cè)曲妥珠單抗對(duì)HER2 MBC 患者治療效果好壞的模型。而預(yù)后分子分型的建立可成為制定治療方案的重要依據(jù)，是一種更為積極主動(dòng)的腫瘤防治方法。

此篇文獻(xiàn)解讀可結(jié)合上周四進(jìn)行的文獻(xiàn)解讀（→Cell文獻(xiàn)解讀丨同是研究三陰乳腺癌，為何偏偏它有28分？）共同來(lái)看，兩篇講的都是高級(jí)生信分析。