PCR現(xiàn)在已經(jīng)成為分子實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)配，無論是基因檢測、基因定量、分子克隆、組裝、突變、測序等等，都離不開PCR技術(shù)。在PCR過程中，引物設(shè)計(jì)是非常重要的一環(huán)，特別是qPCR的引物設(shè)計(jì)，決定了我們擴(kuò)增效率是否達(dá)標(biāo)和擴(kuò)增產(chǎn)物是否特異。今天小編為大家舉個(gè)例子，設(shè)計(jì)一對qPCR引物。

qPCR引物設(shè)計(jì)，通常要留意以下幾點(diǎn)：

GC含量50%-60%

Tm值50℃-65℃

上下游引物盡量接近

引物末端最好是G或C

避開二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜區(qū)域

引物盡量在目的基因的3’ 端

引物盡量跨越內(nèi)含子

目的基因是否有不同的剪切變體

……

這么多要注意的怎么辦？！Primer-blast相信很多小伙伴們都用過，只要輸入序列設(shè)置條件就可以設(shè)計(jì)得到理想的引物序列了。但是很多情況下，我們的要求往往不僅于此。下面，我們以人的EGFP（Epidermal growth factor receptor，表皮生長受體因子）基因?yàn)槔?，設(shè)計(jì)一對可以同時(shí)擴(kuò)增其不同剪切變體的qPCR引物！

之前小編已經(jīng)為大家介紹了如何利用NCBI查詢基因結(jié)構(gòu)了（錯(cuò)過了可以戳這里）， 首先查詢Homo EGFP的基因結(jié)構(gòu)：

可以看到，這個(gè)基因有多種不同的轉(zhuǎn)錄本，而前8個(gè)外顯子區(qū)域是完全一致的（綠色小豎線）。我們的目的是將不同的轉(zhuǎn)錄本都擴(kuò)增出來，那將反向引物設(shè)在第8個(gè)外顯子之前就可以實(shí)現(xiàn)了。

在該頁面里繼續(xù)往下拉，找到mRNA和蛋白質(zhì)的GenBank序列號。點(diǎn)擊mRNA的序列號，進(jìn)入GenBank。借助Highlight Sequence Features，我們可以快速確定第8個(gè)外顯子的位置。

點(diǎn)擊Highlight Sequence Features后，瀏覽器的下方就會出現(xiàn)選項(xiàng)，選擇查看Exon，找到第8個(gè)外顯子，這樣就能快速定位了。我們確定了第8個(gè)外顯子到下游至1236bp為止。

確定下游位置后，點(diǎn)擊Pick Primers，就能直接進(jìn)入Primer-Blast的頁面進(jìn)行引物設(shè)計(jì)了。

由上一步我們知道了第8個(gè)外顯子的位置至第1263 bp結(jié)束，那我們設(shè)計(jì)引物時(shí)，反向引物的位置不超過1263 bp。另外，qPCR的產(chǎn)物大小一般不超過300 bp，并且退火溫度設(shè)置在57℃-63℃的范圍內(nèi)，跨外顯子的設(shè)計(jì)有助于辨別基因組DNA的污染……設(shè)置好這些參數(shù)后，我們就可以點(diǎn)擊Get Primers呢。

這時(shí)，NCBI就會彈出來告訴你，這樣的參數(shù)選擇會擴(kuò)增到其他剪切變體，我們勾選不同的剪切變體并提交，就可以獲得合適的引物對了！這些引物對的退火溫度，都在60℃左右。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇特異性好和引物自身互補(bǔ)越少的引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，成功率還是相當(dāng)高的呢！

其實(shí)，Primer-Blast除了可以設(shè)計(jì)引物外，還可以對我們自己設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評價(jià)。返回引物設(shè)計(jì)的頁面，輸入我們設(shè)計(jì)好的上下游引物，其它參數(shù)可以不調(diào)整，提交后，NCBI就會告訴我們這對引物的情況了！

相當(dāng)方便有木有啊～科研小白，受到引物設(shè)計(jì)的“神圣洗禮”后，終將修煉成為PCR達(dá)人。