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280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。 A230 測(cè)定其它碳源物質(zhì)，如酚，糖類(lèi)等； A260 是核酸的吸收峰測(cè) RNA 和 DNA，引物等的濃度用的； A280 是蛋白質(zhì)的吸收峰。 一般的，我們只看 OD260/OD280（Ratio，R）——1.8~2.0時(shí)，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的，不過(guò)要注意，當(dāng)用 Tris 作為緩沖液檢測(cè)吸光度時(shí)，R 值可能會(huì)大于2（一般應(yīng)該是<2.2的）。當(dāng) R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或者其他有機(jī)物的污染比較明顯，你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運(yùn)。當(dāng) R>2.2時(shí)，說(shuō)明 RNA 已經(jīng)水解成單核酸了。 純RNA 的A260/A280的比值為 2.0。 OD260/OD230的比值還表明 RNA 的純度——其值 <2.0 表明裂解液中有亞硫氰胍和β-巰基乙醇?xì)埩?，其?2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀 RNA。 附： 260/230的值，一般不要小于2.0，小的話表明有異硫氰酸胍，β-巰基乙醇或乙醇的殘留。補(bǔ)救的方法是再沉淀一次，然后重復(fù)乙醇洗滌的過(guò)程。但從我的經(jīng)驗(yàn)看，后面RNA丟得很多……因此提RNA時(shí)就注意了 個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，260/230偏小的話，提取時(shí)可以改進(jìn)以下幾點(diǎn)： 1.加氯仿抽提后取少一點(diǎn)上清，不要貪多。 2.加乙醇洗的時(shí)候，多晃幾次，盡量讓RNA沉淀整片懸浮起來(lái)（有時(shí)候確實(shí)浮不起來(lái)也沒(méi)辦法。） 3.棄乙醇的時(shí)候，用槍吸而不是傾倒，倒的話經(jīng)常有液滴留在管壁上，倒不干凈。第一次用藍(lán)槍頭吸，可以不完全吸干，免得吸到沉淀；然后短暫離心把殘余酒精甩到管底，看準(zhǔn)了用白槍頭盡量吸干凈。RNA量大，被白槍頭弄掉一點(diǎn)也沒(méi)關(guān)系。 4.溶解前晾干的時(shí)間可以長(zhǎng)一點(diǎn)，5分鐘也沒(méi)關(guān)系的。標(biāo)準(zhǔn)的做法說(shuō)是不能晾太久，等沉淀開(kāi)始變透明就要加水溶解，但是我晾過(guò)10分鐘的，后面RNA量也很大?？赡芰看?，雖然有些溶解不了，最后濃度還是高。 可能不完全正確，但是以前我出現(xiàn)過(guò)260/230偏小的問(wèn)題，按上面方法改進(jìn)了操作，后面就好了。 還有一種原因可能是多糖類(lèi)雜質(zhì)殘留，可試試用LiCl沉淀。 RNA溶液的 |
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