2017年4月6日

●　●　● 引言

化學(xué)蛋白組學(xué)“獨步江湖”

背景

令人擔(dān)憂的是，與大分子抗體藥物研發(fā)相比（兔子），小分子藥物發(fā)現(xiàn)雖然起步早，但是開發(fā)難度越來越大（烏龜）。因為這是一場沒有終點的賽跑，如果我們沿用傳統(tǒng)的技術(shù)和思路，那么無論我們多努力地緊趕慢跑，兔子趕上烏龜只是時間問題。小分子藥物的發(fā)現(xiàn)，尤其是活性分子和先導(dǎo)藥物的前期發(fā)現(xiàn)，亟需“新技術(shù)和新思維”。我們先來看一下藥物分子發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)技術(shù)及其特點（圖二），傳統(tǒng)技術(shù)主要有三種：1）天然產(chǎn)物篩選，2）小分子庫海量篩選，3）合理化藥物設(shè)計。由于它們固有的發(fā)現(xiàn)耗時漫長，靶點選擇性／毒性難以預(yù)測，化學(xué)改進(jìn)困難和針對靶點少等缺點，導(dǎo)致現(xiàn)在小分子藥物開發(fā)難度逐年增加，具體表現(xiàn)在a)全球在研小分子藥物數(shù)量增長的難可持續(xù)性和b)研發(fā)后期品種高流失率。這也許正是近期大家對小分子藥物研發(fā)前景的憂慮和進(jìn)行重新思考的根本原因。

圖二：藥物分子發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)渠道及其局限性

說到藥物發(fā)現(xiàn)，尤其是藥物的早期發(fā)現(xiàn)，我們就不得不提化學(xué)生物學(xué)。尤其是蛋白質(zhì)組學(xué)的策略，是高效且強大的臨床前藥物研發(fā)方法，可以用于發(fā)現(xiàn)和鑒定新型藥物和靶標(biāo)。新型化學(xué)工具，生物正交化學(xué)技術(shù)，疾病相關(guān)表型系統(tǒng)，化學(xué)信息學(xué)和化學(xué)蛋白組學(xué)的發(fā)展和組合為搞清“藥物-靶-表型”關(guān)系提供了強大和高通量的研發(fā)流程。

化學(xué)生物學(xué)的發(fā)展給藥物的早期發(fā)現(xiàn)，特別是蛋白靶點的鑒定和分子藥理學(xué)的確認(rèn)，提供了眾多的關(guān)鍵技術(shù)（有興趣了解其他技術(shù)的讀者可以參考上海藥物所王明偉教授的一篇簡要綜述）(Zhu et al., Archives of pharmacal research, 2015)。本篇主要關(guān)注化學(xué)生物學(xué)的一個分支，化學(xué)蛋白組學(xué)，點評一下相關(guān)前沿技術(shù)在活性分子和先導(dǎo)藥物發(fā)現(xiàn)中潛在價值。(Nguyen et al., Methods in molecular biology, 2017)（以后可能陸續(xù)探討化學(xué)生物學(xué)的其它技術(shù)在藥物發(fā)現(xiàn)中應(yīng)用。）

與傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)思路的“萬箭連發(fā)”地“死磕”一個靶點相比，基于化學(xué)蛋白組學(xué)的早期藥物發(fā)現(xiàn)思路是“萬靶俱備，只欠好箭”（圖三）?！昂眉敝傅木褪墙Y(jié)構(gòu)新穎，對靶點的潛在選擇性好的化學(xué)分子，而“萬靶”就是細(xì)胞或組織里的蛋白集合，即蛋白組學(xué)。通過設(shè)計和制備結(jié)構(gòu)多樣化的各種“分子箭”，然后運用各種現(xiàn)代分析技術(shù)考察“分子箭”同時面對眾多靶點時的親和性和選擇性，從而找出最佳的藥-靶關(guān)系，即活性分子／先導(dǎo)藥物和相應(yīng)的靶點的各種信息?？梢哉f，基于化學(xué)蛋白組學(xué)的藥物發(fā)現(xiàn)是集“精湛的分子設(shè)計和合成”與“高超的分子分析”于一身的一門藝術(shù)，因此我選擇這一主題作為對醫(yī)藥研發(fā)社交平臺（現(xiàn)在叫“藥時代”）的第一篇供稿。

圖三：藥物發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)技術(shù)與基于化學(xué)蛋白組學(xué)新技術(shù)的效率比較示意圖

蛋白組學(xué)的發(fā)展初期，主要依靠2D蛋白膠＋Edman降解或短肽質(zhì)譜鑒定蛋白，近十幾年來，快速發(fā)展的質(zhì)譜技術(shù)配合強大的SEQUEST算法，使得蛋白組學(xué)能夠?qū)崿F(xiàn)全局蛋白的快速鑒定和定量分析。這一技術(shù)進(jìn)展緣于人們渴望獲得病變前后蛋白表達(dá)水平變化模式，有了這些信息，就可以去解釋病因了，遺憾的是，這一嘗試并沒有像預(yù)期的效果好?！盁o心插柳柳成蔭”。有趣的是，與有機(jī)合成化學(xué)結(jié)合的蛋白組學(xué)，誕生了化學(xué)蛋白組學(xué)，因為它擅長于分析活性分子或者藥物分子作用前后靶點蛋白的信息變化，開始在新藥發(fā)現(xiàn)中展示出“獨步江湖”的魅力。

也許藥物合成化學(xué)家們都有一個夢想，那就是，可以快速地獲取自己合成的分子跟細(xì)胞內(nèi)所有靶點蛋白結(jié)合強弱的全部信息。但是現(xiàn)實很殘酷，目前只有約100～300萬個分子被人為地放入各種分子庫，從而有幸被某些單一靶點“翻牌”，步入高通量篩選的“寢宮”。而大多數(shù)人類創(chuàng)造出來的分子只是孤獨地躲在某個無人注意的角落，暗自神傷，終身無法被某個靶點“親睞”，更不用提它們可以有機(jī)會去“閱人無數(shù)”，跟細(xì)胞內(nèi)所有靶點蛋白來一次“集體相親”。

這樣殘酷現(xiàn)實的原因，是人類還沒有開發(fā)出靈敏和準(zhǔn)確的通用方法，去普查藥物分子和所以蛋白的結(jié)合關(guān)系。令人欣慰的是，近些年來藥物發(fā)現(xiàn)的江湖上冒出了一個小哥——人稱“化學(xué)蛋白組學(xué)”，骨骼清奇，他有著父親高貴的血統(tǒng)（蛋白組學(xué)），只不過跟著母親（有機(jī)化學(xué)），出身卑微，機(jī)緣巧合中，他習(xí)得了四大絕技，使它迅速在江湖新秀中脫穎而出，開始了“獨步江湖”的歷程。他的出現(xiàn)，為無數(shù)苦悶的化學(xué)分子尋找心儀的靶點蛋白，帶來了一點希望。

I 龍爪手——共價鍵擒靶法

化學(xué)蛋白組學(xué)小哥的第一個絕技，少林龍爪手，屬于擒拿絕技之一，是武俠小說里有名的武功之一，用于近身擒拿或者制服對手。那么他的龍爪手是怎么擒拿目標(biāo)靶點的呢？受到共價鍵藥物的啟發(fā)（圖四），最初的化學(xué)蛋白組學(xué)通過共價鍵擒靶法，利用已知小分子或分子片段，跟細(xì)胞或者細(xì)胞裂解液里的成千上萬的蛋白作用。因為這些小分子裝配著一個親電基團(tuán)，它們可以與含有高活性親核基團(tuán)（絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸殘基）的蛋白質(zhì)形成共價綴合物，于是靶點就被小分子通過共價鍵牢牢的“抓住”了。因為共價鍵牢固，分子／蛋白綴合物可以任你“煎炸蒸煮”而不分開，極大地幫助了靶點鑒定。

舉個例子，利用廣譜的親電試劑α碘代酰胺，可以一次抓到890個含有半胱氨酸的蛋白。(Weerapana et al., Nature, 2010)

圖四：共價鍵藥物發(fā)展歷史（來自wiki）

但是“龍抓手”的修煉可不容易，如圖五所示，小分子（跟蛋白結(jié)合的骨架部分，圖五c）需要進(jìn)行化學(xué)改造，加上化學(xué)活性官能團(tuán)如Michael受體，環(huán)氧基團(tuán)，酸酐和?；u化物（圖五a），或者光激發(fā)偶聯(lián)基團(tuán)（圖五b），以及報告基團(tuán)如生物素（用于富集）和熒光素（用于顯色）（圖五d）。為了減小探針尺寸，也可以先用炔基和疊氮替代報告基團(tuán)（圖五e），在生物樣品處理后期通過click chemistry加上報告基團(tuán)(Niphakis and Cravatt, Annual review of biochemistry, 2014)?！褒堊ナ帧钡囊粋€明顯缺陷是，一個分子本來可以結(jié)合某些蛋白，但是因為它被改造了，結(jié)果很可能不再跟原來的蛋白結(jié)合了。 換句話說，分子已經(jīng)不是原來的分子了。因此，這一方法的最大的瓶頸是探針分子的設(shè)計和合成。令人鼓舞的是，近年來C－H直接官能團(tuán)化的快速進(jìn)展為解決這一難題帶來了可能。(Dai et al., J Am Chem Soc, 2011)

圖五：用于“龍抓手”的三官能團(tuán)探針模塊，來自(Niphakis and Cravatt, Annual review of biochemistry, 2014)

經(jīng)歷了第一步分子設(shè)計和第二步分子合成，得到的三官能團(tuán)分子（結(jié)合，反應(yīng)活性和報告三個基團(tuán)），第三步便是讓它們跟細(xì)胞或者活體動物作用并進(jìn)行樣品前處理和收集，第四步是儀器測試進(jìn)行數(shù)據(jù)收集并分析出可能靶點，最后一步是靶點驗證。

“舉個例子，利用帶有炔基的beta內(nèi)酰胺探針分子，尋找到了蛋白水解酶ClpP的選擇性抑制劑。（圖六）(Bottcher and Sieber, Angewandte Chemie, 2008)”

圖六：用beta內(nèi)酰胺探針分子尋找蛋白水解酶ClpP的選擇性抑制劑，來自(Bottcher and Sieber, Angewandte Chemie，2008)

近一兩年來，這一領(lǐng)域出現(xiàn)了一系列重大突破，發(fā)表了幾篇CNS級的工作：如利用高度疏水的分子探針專門抓膜蛋白靶點，發(fā)現(xiàn)了與分子探針結(jié)合的280個drugbank收錄的膜蛋白和高達(dá)840個非drugbank膜蛋白(Niphakis et al., Cell, 2015)。 另一個工作是利用跟半胱氨酸特異反應(yīng)的片段探針庫，抓到637個靶點蛋白，其中92個在drugbank里面，而高達(dá)545個蛋白還沒有被drugbank收錄(Backus et al., Nature，2016)。最后一個工作更牛，是利用含有光激發(fā)偶聯(lián)基團(tuán)的片段探針庫，收集到了幾萬組小分子和靶點蛋白的相互作用信息(Parker et al.，Cell，2017)。

下篇預(yù)告：

“II 吸星大法——激酶珠球篩選法

III 金鐘罩——蛋白穩(wěn)定性尋靶法

IV 引天雷——誘導(dǎo)滅靶法

V 展望”

倪鋒 廈門大學(xué)化學(xué)系學(xué)士，有機(jī)化學(xué)博士。南加州大學(xué)化學(xué)系博士后，高級研究員，高級科學(xué)家研究員?。先后十余年一直從事功能探針和藥物探針分子設(shè)計，并應(yīng)用于生物固氮酶，蛋白激酶和GPCR蛋白的研究。?現(xiàn)擔(dān)任洛杉磯TarGead Sciences CEO，利用高通量先導(dǎo)藥物和靶蛋白發(fā)現(xiàn)技術(shù)平臺，進(jìn)行先導(dǎo)藥物/靶點發(fā)現(xiàn)并轉(zhuǎn)讓授權(quán)，同時向醫(yī)藥研發(fā)同行提供先導(dǎo)藥物/靶點驗證服務(wù)與靶點發(fā)現(xiàn)合作。

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參考文獻(xiàn)：

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