摘   要

圖 1：林圣彩 教授 冷泉港 2018 報(bào)告現(xiàn)場(chǎng)

3 月 26 日（本周一）晚，在 “2018 冷泉港亞洲：癌癥與代謝” 會(huì)議的主題報(bào)告上林圣彩教授帶來了 AMPK 最新的研究成果。林教授系統(tǒng)的介紹了 AMPK 作為糖感受器這一改寫教科書式發(fā)現(xiàn)的研究歷程。其通路逐步闡明的故事也為廣大科研工作者提供了很好的參照。

作為林教授的 “粉絲”，此次有幸在現(xiàn)場(chǎng)聽到了林教授風(fēng)趣的演講和研究歷程的故事，小編將林教授的分享再結(jié)合其科學(xué)發(fā)現(xiàn)和研究思路整理如下，希望能給大家?guī)硪稽c(diǎn)啟發(fā)。一隅之見，如有謬誤，望不吝賜教。

此文證明了 AXIN 是一個(gè)橋梁，不僅在經(jīng)典的 Wnt 通路中起作用，而且也 “意外發(fā)現(xiàn)” 其將 AMPK 和其上游激酶 LKB1 連接在一起 [7]。此三者形成一個(gè)復(fù)合體，促進(jìn) LKB1 對(duì) AMPK 的磷酸化激活，使得 AMPK 的活性升高，從而完成信號(hào)傳遞過程。當(dāng)時(shí)這篇文章認(rèn)為 AMP 在其中起到最關(guān)鍵的作用，而尚未明確此文中采取的糖饑餓這種刺激因素實(shí)際上也能成為 AMPK 還是糖感受器的一個(gè)證據(jù)，也為后面更升華的研究埋下伏筆。

AMPK 之外，mTOR 也是細(xì)胞代謝通路的一條主要通路。mTORC1 是重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，能夠控制調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成代謝、增殖、蛋白翻譯合成等一系列合成代謝途徑。相對(duì) “貧窮” 感知者：分解代謝通路的 AMPK，林教授將合成代謝通路的 mTOR 比喻為細(xì)胞感知 “富足” 狀態(tài)的關(guān)鍵分子。

小分子 GTP 酶 Rheb，在與 GTP 結(jié)合的狀態(tài)下，是 mTORC1 激酶活性所需的強(qiáng)效刺激劑，并且受到其 GAP（即TSC1/2）的負(fù)性調(diào)控。在經(jīng)典通路中，絕大多數(shù)上游輸入信號(hào)通過 Akt 和 TSC1/2 來調(diào)節(jié) Rheb 的核苷酸負(fù)載狀態(tài)，AMPK 對(duì) mTORC1 的負(fù)調(diào)控也不例外。

與這種通過 “PI3K/Akt – TSC 復(fù)合物- Rheb” 軸的中心調(diào)控方式相對(duì)應(yīng)的，氨基酸信號(hào)以獨(dú)立于軸的方式將信號(hào)指向 mTORC1 ，并促進(jìn) mTORC1 轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體表面，在溶酶體可與 Rheb 接觸并激活。這一過程由多種復(fù)合體的協(xié)調(diào)行動(dòng)來介導(dǎo)，主要包括 v-ATPase – Ragulator - Rag。 Rag 是一類 GTPase，由 A、B、C、D 四個(gè)成員組成，Rag A/B 的 GTP 結(jié)合形式能將 mTORC1 轉(zhuǎn)位到內(nèi)涵體表面。Ragulator 復(fù)合物是由 LAMTOR 1/2/3/4/5 組成的五聚物，能將 Rag 定位到內(nèi)涵體膜，并且可以作為其鳥苷酸交換因子（GEF）。V-ATPase 能夠感受能量和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，刺激 Ragulator 的 GEF 活性，進(jìn)而使得 Rag A/B 由 GDP 結(jié)合形式轉(zhuǎn)化為 GTP 結(jié)合形式，從而增加 Rag 同 mTORC1 的親和力，最終導(dǎo)致 mTORC1 轉(zhuǎn)位到溶酶體表面 [8]。

圖 4：經(jīng)典的 mTOR 信號(hào)通路。點(diǎn)擊查看 mTOR 信號(hào)通路的簡(jiǎn)介和熱門靶點(diǎn)抗體產(chǎn)品。

那么，在經(jīng)典的 “TSC 復(fù)合物- Rheb” 軸之外，是否還存在 AMPK 對(duì) mTOR 調(diào)控的另外作用機(jī)制？在不同能量和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下這兩條經(jīng)典的通路如何對(duì)話？林教授課題組 2014 年發(fā)表的論文給出了證明：溶酶體 v-ATPase - Ragulator 復(fù)合物是 AMPK 和 mTORC1 的共同激活因子，是合成代謝和分解代謝的重要開關(guān) [8]。其研究思路簡(jiǎn)單總結(jié)如下（詳細(xì)請(qǐng)見文末參考文獻(xiàn)原文）：

Figure 1 明確第一主角和前文關(guān)聯(lián)： LAMTOR1 在 AXIN 激活 AMPK 作用中是必須的。

• 方法：用 siAXIN 證明 LAMTOR1 和 AXIN 有互作；肝臟特異性敲除、肌肉特異性敲除 LAMTOR1 小鼠中，檢測(cè) AMPK 活性和下游功能；LAMTOR1 敲除原代細(xì)胞或 RNAi 模型中檢測(cè) AMPK 在糖饑餓、不同激動(dòng)劑下的作用。

• 所用技術(shù)：coIP，WB、生化檢測(cè)、siRNA。

Figure 2 第一主角調(diào)控細(xì)節(jié)闡明：葡萄糖饑餓介導(dǎo) Ragulator-AXIN/LKB1-AMPK 復(fù)合物在內(nèi)涵體形成。

• 方法：細(xì)胞和動(dòng)物模型中，結(jié)合條件性敲除，siRNA 證明蛋白互作和共定位。找到點(diǎn)突變，補(bǔ)充證明互作重要性。找到干預(yù)晚期內(nèi)涵體的指標(biāo)，進(jìn)一步證明內(nèi)涵體定位的重要性。

• 所用技術(shù)：coIP、Pulldown、WB、密度梯度分離、IF、siRNA、激酶活性檢測(cè)。

Figure 3 做實(shí)調(diào)控功能，確實(shí)是全新發(fā)現(xiàn)的通路：LAMTOR1 降低 pAMPK 激活所需的 AMP 濃度閾值。

• 方法：LAMTOR1 敲除模型中檢測(cè) AMP 不同濃度作用下的 AMPK 激活。關(guān)鍵活性位點(diǎn)的點(diǎn)突變、激活劑、通路上下游檢測(cè)等方法，排除經(jīng)典作用通路，說明 LAMTOR 對(duì) AMPK 的激活為全新通路。

• 所用技術(shù)：WB、點(diǎn)突變。 

Figure 4 進(jìn)一步鏈接框架，印證新穎性：AXIN 在 LKB1 轉(zhuǎn)位至內(nèi)涵體過程中起到支架蛋白的作用。

• 方法：敲低 AXIN 的情況下做 LAMTOR1 和 AMPK、mTORC1 復(fù)合物的互作、共定位。梯度離心印證細(xì)胞亞定位。并排除 AMPKa 自身及 TSC 復(fù)合物經(jīng)典通路在定位和互作中的主要作用，進(jìn)一步印證本研究的新穎性。

• 所用技術(shù)：coIP、IF、WB、密度梯度分離。

Figure 5 再點(diǎn)出第二主角：v-ATPase 和 Ragulator 共同扮演主要感受器促使 AXIN/LKB1 的轉(zhuǎn)位

• 方法：將 v-ATPase 拉入互作證明體系。配合體外結(jié)合、激動(dòng)劑處理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

• 所用技術(shù)：coIP、IF、WB、密度梯度分離、siRNA。

Figure 6 第二主角的功能和機(jī)制再明確：AXIN 在 v-ATPase 抑制導(dǎo)致的 mTOR 從內(nèi)涵體解離中起到協(xié)助作用

• 方法：敲低 AXIN、敲低 AMPK、突變 AXIN 上 LAMTOR 結(jié)合位點(diǎn)等的情況下做 AMPK、mTORC1 復(fù)合物、vATPase 互作和功能改變。

• 所用技術(shù)：coIP、IF、WB、密度梯度分離。

Figure 7 鏈接到經(jīng)典通路的功能中，完善整體機(jī)制： AXIN 抑制 Ragulator 對(duì)Rags 的 GEF 活性，補(bǔ)上機(jī)制作用鏈條的最后一環(huán)節(jié)

• 方法：敲低 AXIN、缺失突變 AXIN、敲低 LAMTOR1 的情況下看復(fù)合物成分的變化。并檢測(cè) GTP 結(jié)合形式 Rag 的變化，證明 AXIN 對(duì) mTORC1 轉(zhuǎn)位激活復(fù)合物的抑制作用機(jī)制。

• 所用技術(shù)：WB、coIP、Pulldown、GEF 活性檢測(cè)。

圖5：溶酶體 v-ATPase- Ragulator 復(fù)合物是 AMPK 和 mTORC1 的共同激活因子，是合成代謝和分解代謝的重要開關(guān)機(jī)制證明，及作用模式圖 [8]。

此研究的重要意義在于經(jīng)典的兩大細(xì)胞代謝通路由于 AXIN - V-ATPase– Ragulator-Rag 互作復(fù)合物的存在，在溶酶體上關(guān)聯(lián)到了一起。發(fā)現(xiàn)了一條區(qū)別于經(jīng)典 AMPK-mTOR 調(diào)控模式的新途徑。以 mTOR 為代表的合成代謝途徑和以 AMPK 為代表的分解代謝途徑，實(shí)際上有著之前為人不知的更廣泛的聯(lián)系和密切相互作用 [7]。這也為代謝穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制探索和相關(guān)藥物作用機(jī)理的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)提供了重大依據(jù)。

“萬能神藥” 二甲雙胍作用機(jī)制的揭示就提供了一個(gè)有力證明。林教授課題組的進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)了二甲雙胍能通過 V-ATPase – Ragulator，作用于 AXIN-LKB1，最終激活 AMPK 并抑制 mTORC，為揭示經(jīng)典藥物的藥理機(jī)制提供了重要參考 [9]。

Figure 1 現(xiàn)象闡述，揭示新機(jī)制：葡萄糖饑餓激活 AMPK 不依賴于 AMP/ADP

• 方法：葡萄糖梯度下 AMPK 活性變化，和 AMP/ADP 的比值變化。糖和氨基酸缺失培養(yǎng)基作用不同時(shí)間下的 AMPK 活性變化。及伴隨的 AMP/ADP 比值變化。

• 所用技術(shù)：激酶活性檢測(cè)、LC-MS。

Figure 2 做實(shí)表型的新通路：葡萄糖饑餓激活 AMPK 依賴于溶酶體途徑，排除能量應(yīng)激效應(yīng)

• 方法：糖和氨基酸缺失培養(yǎng)基作用不同時(shí)間下的 AMPK 的活性變化時(shí)， AMPK 相關(guān)蛋白的激活情況。點(diǎn)突變關(guān)鍵蛋白 AMPKβ2 的關(guān)鍵點(diǎn) G2A，證實(shí)豆蔻?；嚓P(guān)的溶酶體機(jī)制的關(guān)鍵作用。并排除通過其他途徑的信號(hào)傳遞可能性。

• 所用技術(shù)：激酶活性檢測(cè)、WB、點(diǎn)突變、CRISPR-Cas9。

Figure 3 篩到關(guān)鍵代謝物：FBP 缺失是饑餓激活 AMPK 的關(guān)鍵代謝物信號(hào)

• 方法：上游 HK 酶 RNAi 之后的檢查糖刺激下的 AMPK 通路。并利用體外重構(gòu)體系的對(duì)比操控，篩查驗(yàn)證關(guān)鍵化合物節(jié)點(diǎn)。然后再利用不同細(xì)胞模型直接驗(yàn)證。

• 所用技術(shù)：siRNA、coIP、WB。

Figure 4 找到與關(guān)鍵代謝物互作的關(guān)鍵酶，補(bǔ)全機(jī)制：ALDO 是 FBP 作用于葡萄糖饑餓激活 AMPK 信號(hào)的物理連接點(diǎn)

• 方法： ALDO-TKD（A，B，C 三者同時(shí)敲除）后 AMPK 的激活情況檢查。合并 AXIN 敲除。點(diǎn)突變 ALDOA 后檢查證明關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)情況。

• 所用技術(shù)：siRNA、coIP、WB、Pulldown。

圖 7：果糖 1,6-二磷酸（FBP）和醛縮酶（ALDO）可以介導(dǎo) AMPK 感知葡萄糖，及作用模式圖 [10]。

雖然這里只按照論文的正圖主線講解了行文的邏輯，但是背后大量的工作和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼撟C，讓我充分信服 AMPK 作為糖感受器的堅(jiān)實(shí)分子基礎(chǔ)。這篇文章顛覆了傳統(tǒng)認(rèn)為的：AMPK 需要依賴于 AMP 結(jié)合才能活化的認(rèn)知。研究也開創(chuàng)了醛縮酶以及糖酵途徑成為 AMPK 調(diào)節(jié)新途徑，以及 AMPK 可以作為糖感受器調(diào)控代謝過程的新認(rèn)知 [10]。

文章還側(cè)面印證了 AMPK 作為能量感受器和糖感受器的雙重功能。這也是在急性葡萄糖饑餓期間，細(xì)胞 AMP：ATP 能量供給能維持不變現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)。首先 AMPK 作為葡萄糖傳感器，其次作為監(jiān)測(cè)能量狀態(tài) AMP：ATP 的傳感器。AMPK 的雙重功能能夠獨(dú)立運(yùn)作，也會(huì)彼此增強(qiáng) [11]。這種能量和糖的穩(wěn)定對(duì)于細(xì)胞正常的生理功能穩(wěn)態(tài)的維持起到重要作用。