代謝組學(xué)主要研究的是作為各種代謝路徑的底物和產(chǎn)物的小分子代謝物（MW<>

其樣品主要是尿液，血漿或血清，唾液，以及細(xì)胞和組織的提取液。

細(xì)胞：1*10⁷

以動物細(xì)胞兩種形態(tài)為例                                                                               

1.懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞：

• 連同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15 mL的離心管（進(jìn)口）中

• 低速離心，使細(xì)胞沉淀于離心管的底部（1*10⁷個細(xì)胞為宜）

• 倒掉培養(yǎng)基（盡量倒干凈）后（可以用PBS快速清洗一次，再次離心，倒掉PBS（盡量倒干凈），將離心管的尖端插入液氮中，淬滅細(xì)胞

•  -80度凍存，干冰郵寄，每個樣品最好準(zhǔn)備兩管。

2.貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞：

• 快速倒掉培養(yǎng)基

• 倒入PBS（若用移液槍加，則靠著培養(yǎng)皿壁加入，以免將細(xì)胞沖起），清洗一次，

• 倒掉PBS，用移液器吸盡殘余的PBS，將培養(yǎng)皿底部（外壁）接觸液氮10 s，淬滅細(xì)胞

• 加入500微升預(yù)冷的甲醇-水（4：1，V/V）（需色譜純的甲醇以及雙蒸餾水），

• 用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，移液槍轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中

• 向培養(yǎng)皿中加入500微升預(yù)冷的甲醇-水（4：1，V/V）

• 將剩余的細(xì)胞盡量全部轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中

• -80度凍存，干冰郵寄。

血清：200ul

1. 用離心管收集血液，37℃（或室溫）靜置 30min或1h 進(jìn)行凝固分層；

2. 3000rpm 4℃或常溫 離心10min，待血細(xì)胞完全沉降都管底后，取上清轉(zhuǎn)至干凈的離心管中；

3. 12000rpm 4℃離心10min，取上清分裝到1.5mL EP管中，每管 0.1-0.2mL；

4. -80℃冰箱凍存。足量干冰寄送。

血漿：200ul

1. 用肝素鈉抗凝管（肝素、肝素鈉、肝素鋰）采集全血，并盡快進(jìn)行血漿分離；

2. 采血后盡快于3000 rpm（4℃），離心15 min，待血細(xì)胞完全沉降都管底后，吸取上層血清，用EP管分裝，取上層，每管0.1-0.2mL分裝至1.5mL EP管內(nèi)中；

3. -80℃冰箱凍存。足量干冰寄送。

尿液：1mL

1. 晨起中段尿（臨床）或晨間1h尿（動物）直接分裝到離心管（進(jìn)口）中，每管1mL；添加質(zhì)量體積為1/100（w/v）的疊氮化鈉；

2. 收集好的尿液10000-15000轉(zhuǎn)/分鐘，于4℃溫度下離心10分鐘后，吸取中層澄清的尿液，用進(jìn)口的1.5 mL離心管分裝保存，200微升/管，最好保存兩管，以保證兩次實(shí)驗(yàn)的量。

3. -80℃冰箱凍存，足量干冰寄送。

唾液：0.5 mL

禁食禁煙禁酒1h以上

上午9:30-11:30取樣，蒸餾水漱口，將唾液外吐于無菌痰杯內(nèi)（保持冰?。?，不要咳痰，收集5-10min，4℃，12000rpm，離心20min，取上清，再經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，500ul分裝，保存于-80℃。

糞便或腸道內(nèi)容物：200mg-5g

1. 收集到新鮮糞便或腸道內(nèi)容物樣本，從糞便的不同部位挑3個點(diǎn)，稱5g/例放到離心管中；

2. 添加一滴（約10uL）質(zhì)量體積比為1/100（w/v）的疊氮化鈉（1mg/ml），分裝樣本200mg/管；

3. 迅速放入液氮中冷凍處理至少15min；

4. -80℃冰箱凍存。足量干冰寄送。

常規(guī)動物組織（心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、肌肉等）：200mg最佳

1. 如果組織上有血，先用用生理鹽水漂洗掉；

2. 根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計取特定的部位，200mg/管裝入標(biāo)記好的離心管中；

3. 迅速放入液氮中冷凍處理至少15min；

4. -80℃冰箱凍存。足量干冰寄送。

代謝組學(xué)基于多元統(tǒng)計分析方法進(jìn)行的，在樣品準(zhǔn)備上相對于轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組而言需要更多的重復(fù)數(shù)據(jù)。

1.         一般建議植物樣品：最少6次，建議8次生物學(xué)重復(fù)；

2.         模式動物及微生物樣品：最少8次，建議10次生物學(xué)重復(fù)；

3.         臨床樣品：30次生物學(xué)重復(fù)以上，如組織樣品取樣不便，可控制在20次重復(fù)以上。

代謝物在不同組織樣品中差異較大，為了可靠的統(tǒng)計學(xué)以及生物學(xué)分析：

1.         微生物與植物樣本：每組最小樣本數(shù)8個；

2.         模式動物最小樣本數(shù)：10個；

3.         臨床樣本最小樣本數(shù)：30個。

1. 機(jī)械法：處理量大，速度快；例如球磨法、高壓勻漿法、X-壓榨法和超聲波法等；

2. 酶解法：利用水解酶破壞細(xì)胞壁中的聚合物成分；例如溶菌酶可水解細(xì)菌、放線菌細(xì)胞壁上的肽聚糖，纖維素酶可水解植物細(xì)胞壁上的纖維素，蝸牛酶可水解真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)和甘露聚糖等；

3. 其他方法：包括細(xì)胞自溶法、滲透沖擊法、反復(fù)凍融法、酸堿處理法和表面活性劑處理法等。

易揮發(fā)性的物質(zhì)，收集過程中難免會有丟失，如果氣體或者極易揮發(fā)可采用進(jìn)樣小瓶收集。

含易氧化的物質(zhì)的樣品收集要快，盡量少暴露于空氣中，避空保存，有條件可以抽真空。

微生物代謝速度非常快，所以所有的步驟需要盡快完，且每個樣本量一樣多。

代謝物在不同的樣品中，種類各異，一般植物20萬種、動物2500種、微生物1500種

在GC-MS平臺：血液400左右，尿液600左右，動植物組織或細(xì)胞在500到1000+不等，與生物種類有關(guān)；

LC-MS平臺可以檢測到的物質(zhì)峰可以達(dá)到幾千甚至上萬，但是由于數(shù)據(jù)庫的限制，目前都是做完差異分析后再做定性，一般代謝物會控制在200個左右。

代謝物檢測質(zhì)控主要是為了保證樣品檢測過程的準(zhǔn)確性，對提取或檢測過程中差異較大的樣品或代謝物質(zhì)進(jìn)行分析判斷。

例如，檢測100個樣品中代謝物質(zhì)，在提取樣品之后，從100個樣品中各吸取部分樣品，先作為一個混和樣品。隨后，在100個樣品的儀器分析的過程中，可以在每20個樣品跑樣過程中插入檢測一個混合樣品，最后通過分析混樣在前后五六次代謝檢測數(shù)據(jù)穩(wěn)定性，判斷樣品的好壞。

氣相色譜僅適用于沸點(diǎn)低、熱穩(wěn)定性好的小分子物質(zhì)的分離分析，對沸點(diǎn)高、揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、極性強(qiáng)甚至極易揮發(fā)的物質(zhì)往往不能直接進(jìn)樣分析。

生物樣本中含有大量的羥基、胺基、羧基、巰基等官能團(tuán)的物質(zhì)信息，因此采用適當(dāng)?shù)难苌幚矸椒▽τ跇悠返姆蛛x分析往往起著十分重要的作用。

樣品的衍生化方法的益處有：

1. 將一些不適合色譜分析的物質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)處理轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的揮發(fā)性衍生物，可以擴(kuò)大氣象色譜的測定范圍；

2. 改變同分異構(gòu)化合物的色譜性能，提高和改善樣品的峰形和分離度，克服載體、柱壁對高極性、低揮發(fā)樣品的吸附。甚至通過特殊的衍生方法，分離手性化合物；

3. 改善待測物質(zhì)的熱穩(wěn)定性，以提高檢測的靈敏度；

4. 改善待測物質(zhì)的質(zhì)譜行為，有利于鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。

非模式生物往往生物信息數(shù)據(jù)量少，不太適合直接進(jìn)行組學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，一般建議將非模式生物的數(shù)據(jù)通過同源比對的方式映射到模式生物上，然后再以模式生物的數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。

土壤中成分非常復(fù)雜，如含有營養(yǎng)物質(zhì)，垃圾物質(zhì)，動植物殘留，微生物等成分。因此，對于，土壤不推薦進(jìn)行代謝組學(xué)研究。

不同的飼料，成分不一，也需要根據(jù)飼料的組成的復(fù)雜度來判斷是否適合于代謝物分析。在適合代謝物研究的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)設(shè)計可以參考動植物代謝組研究。

色譜與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)了從利用色譜進(jìn)行物質(zhì)分離到利用質(zhì)譜進(jìn)行物質(zhì)鑒定的整個流程，且色譜，質(zhì)譜的類型較為廣泛。

對于質(zhì)譜而言，為了實(shí)現(xiàn)代謝物的定性與定量兩個目的，應(yīng)該選擇不同的儀器進(jìn)行綜合分析。

• 定性分析：可利用核磁共振質(zhì)譜，高分辨的質(zhì)譜與三重四級桿質(zhì)譜一起進(jìn)行；

• 定量分析：利用基于三重四級桿系統(tǒng)的質(zhì)譜，如QTrap，則更為準(zhǔn)確。

• 常用的高分辨質(zhì)譜：TOF-MS，Orbitrap-MS；

• 三重四級桿系統(tǒng)的質(zhì)譜：主要為QTrap與3Q系統(tǒng)的質(zhì)譜。

主要從如下方面考察：

（1）樣本的代謝物的提取和檢測是否得到足夠多的峰；

（2）組間分群是否好。

廣泛靶向：廣泛靶向代謝組學(xué)既有非靶向代謝組學(xué)的優(yōu)點(diǎn)也有靶向代謝組學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。這種廣泛靶向的是不需要標(biāo)準(zhǔn)品的，這項技術(shù)是在前期已經(jīng)建立了公共數(shù)據(jù)庫以外的更多的代謝物，他的數(shù)據(jù)庫更加完善，可以檢測到更多。

并且這個技術(shù)使用的是三重四級桿，這個是使用在靶向代謝組學(xué)上的技術(shù)，所以說它具有靶向代謝組的優(yōu)點(diǎn)。

高靈敏度: 通過離子井進(jìn)行富集 可以檢測到很多低豐度的次生代謝物,而非靶技術(shù)無法檢測到低豐度物質(zhì)；定性準(zhǔn)確：相比非靶技術(shù)，廣靶利用分子量的同時利用二級譜進(jìn)行物質(zhì)定性；

數(shù)據(jù)庫全：每個物種都可以自建數(shù)據(jù)庫，建立屬于該物種特有的代謝庫。

不應(yīng)該疊加。另外需要注意的是，重名的代謝物，需要根據(jù)保留時間，分子量，分解譜等方法來判斷，它們是不是同一個代謝物，如果不是，命名的時候必須予以區(qū)別，相應(yīng)地，在數(shù)據(jù)分析時候單獨(dú)對待。