規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（CRISPR）-Cas技術(shù)是一種革命性的基因編輯方法，它利用可編程的RNA來指導(dǎo)核酸酶尋找基因組中的特定目標(biāo)位置。這種簡單的方法取代了之前那些繁瑣又昂貴的DNA編輯技術(shù)，如基于蛋白質(zhì)的鋅指核酸酶（ZFN）或轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）。

自從最初幾篇介紹CRISPR-Cas技術(shù)在原核和真核細(xì)胞中的基因組編輯應(yīng)用的文獻(xiàn)發(fā)表以來，這種技術(shù)在全球?qū)嶒炇业膽?yīng)用呈指數(shù)級增長。 潛在的應(yīng)用領(lǐng)域包括基礎(chǔ)研究、治療、農(nóng)業(yè)和環(huán)境研究。

2016年，也就是基因編輯首次引入人體試驗兩年后，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）首次批準(zhǔn)了CRISPR-Cas9技術(shù)在人體試驗中的應(yīng)用。這項決策有望通過細(xì)胞替換，在未來實現(xiàn)罕見遺傳病、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染和惡性血液病的治療。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)來源于原核生物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，它靶定并切割噬菌體或質(zhì)粒的入侵遺傳元件。任何DNA編輯工具的效果和安全性都高度取決于特異性。一些研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR-Cas9的使用可能導(dǎo)致意外的脫靶效應(yīng)?；谶@個原因，一些研究小組正在開發(fā)檢測和降低脫靶效應(yīng)的方法。

CRISPR位點以及CRISPR-Cas9技術(shù)的機制

細(xì)胞和古細(xì)菌在適應(yīng)性免疫中使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)。CRISPR位點由短回文重復(fù)序列組成，它們被稱為“間隔序列”的非重復(fù)短序列隔開。間隔序列來源于入侵的DNA，如噬菌體，在感染發(fā)生時它們復(fù)制并摻入CRISPR位點。在這個位點附近，另一個位點則包含一套編碼CRISPR相關(guān)的內(nèi)切核酸酶（Cas）的基因，這種酶在基因組中引入切口。

當(dāng)相同的入侵DNA重復(fù)感染時，RNA分子（CRISPR RNA或crRNA）將與Cas和反式激活crRNA（tracrRNA）形成復(fù)合物，指導(dǎo)核酸酶抵達(dá)外源序列所在之處。

Cas-RNA復(fù)合物將識別與crRNA互補并與特定的三核苷酸位點（前間區(qū)序列鄰近基序或PAM）相鄰的DNA目標(biāo)。然后，復(fù)合物將切割和失活入侵的DNA（圖1）。

圖1. CRISPR位點由短回文重復(fù)序列組成，它們被稱為“間隔序列”的非重復(fù)短序列隔開。間隔序列來源于入侵的DNA，如噬菌體，在感染發(fā)生時它們復(fù)制并摻入CRISPR位點。在這個位點附近，另一個位點則包含一套編碼Cas內(nèi)切核酸酶的基因，這種酶在基因組中引入切口。

盡管不同細(xì)菌內(nèi)與CRISPR活性相關(guān)的核酸酶不同，但本綜述中的大部分話題都圍繞著化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes），它依賴內(nèi)切核酸酶Cas9?；谶@個原因，本文主要指的是CRISPR-Cas9技術(shù)。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)需要兩種RNA分子：crRNA（從DNA間隔序列轉(zhuǎn)錄而來）和tracrRNA（它與crRNA的相互作用是招募Cas9所必需的結(jié)構(gòu)）（圖2）。在一項里程碑研究中，這兩種RNA分子雜交形成單鏈向?qū)NA（sgRNA）。這種簡化的Cas9-sgRNA系統(tǒng)證明了基因編輯的特性。

圖2. 動畫顯示Cas9（透明）和sgRNA（紅色）與DNA（藍(lán)色）相互作用的分子結(jié)構(gòu)

在哺乳動物細(xì)胞中，Cas9引入核酸酶誘導(dǎo)的雙鏈斷裂（DSB），它們可通過兩種競爭性的修復(fù)機制中的一種來修復(fù)（圖3）。第一種是非同源末端連接（NHEJ），它更常見但容易出錯，這種修復(fù)帶來插入和缺失突變（indel）。第二種是同源介導(dǎo)的修復(fù)（HDR），在供體DNA模板存在時，這種修復(fù)可實現(xiàn)精確的基因校正或插入。

圖3. CRISPR-Cas9機制的示意圖。Cas9搜索細(xì)胞的基因組內(nèi)與20 bp的sgRNA匹配的序列。一旦發(fā)現(xiàn)，Cas9在匹配的序列中引入DSB。此時，兩種通路將競爭性地修復(fù)引入的斷裂：1) NHEJ以一種容易出錯的機制修復(fù)末端，不需要同源模板，可產(chǎn)生小的插入和缺失。2) HDR機制需要同源序列來指導(dǎo)修復(fù)，可將供體模板插入序列中。