第一部分：原代細(xì)胞的基本知識

1. 什么是原代細(xì)胞培養(yǎng)?

原代細(xì)胞（Primary cells）：是指直接從機(jī)體取出的組織或細(xì)胞獲得單個細(xì)胞并在體外進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞。這里的組織主要指：組織器官、外周血及胚胎等。

原代細(xì)胞培養(yǎng)：由于原代細(xì)胞生長緩慢，繁殖一定的代數(shù)停止生長（一般10代以內(nèi)）。所以一般認(rèn)為：培養(yǎng)的原代的第1和傳代到第10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。

2. 原代細(xì)胞與細(xì)胞系（cell lines）的區(qū)別

原代細(xì)胞和細(xì)胞系的比較：

原代細(xì)胞和細(xì)胞系的比較

3. 原代細(xì)胞的應(yīng)用

由于原代細(xì)胞生物學(xué)特性未發(fā)生很大改變，最接近和反映體內(nèi)生長特性，因此是：

(1) 研究生物體細(xì)胞的生長、代謝、繁殖提供有力的工具；

(2)更好實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療的腫瘤診治模式，實(shí)現(xiàn)個體化精準(zhǔn)用藥的目的。

第二部分：原代細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)

原代培養(yǎng)的原理

將動物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶/膠原酶)、螯合劑(常用EDTA)或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。主要包括取材——分離——培養(yǎng)等3部分；

在原代細(xì)胞應(yīng)用較多的包括：組織器官（如實(shí)體瘤、皮膚等）、懸浮細(xì)胞的取材等。

下面依次介紹：

一、腫瘤組織的取材

病人自體的原代腫瘤細(xì)胞由于更接近臨床患者標(biāo)本，可以更好實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療的腫瘤診治模式，實(shí)現(xiàn)個體化精準(zhǔn)用藥的目的。所以對病人自體腫瘤細(xì)胞體外分離與培養(yǎng)十分必要。

基本過程如下圖所示：

原代腫瘤細(xì)胞的分離步驟

備注：上圖細(xì)胞為肉瘤患者的原代細(xì)胞

具體步驟如下：

1. 在無菌條件下的冰上對新鮮離體的腫瘤組織，剔除包膜及壞死組織，無菌PBS清洗3-5次；切成約1mm³組織塊；

2. 加入2mmol 的 EDTA，搖勻后放置冰上約 30-60min；

3. 離心，并加入膠原酶消化（含蛋白酶）；

4. 消化期間，置于37°培養(yǎng)箱。每15min搖晃一次，消化時間根據(jù)腫瘤組織來定，約1-2h；

5. 待大部分組織塊消化成透明狀時，用 40μm 的細(xì)胞濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，收集；

6. 用培養(yǎng)基重懸，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

常見問題解答：

Q：為什么我取得原代腫瘤組織，分離的卻不是腫瘤細(xì)胞？

A：取材時，我們要熟悉所需組織的類型和部位特征，選擇腫瘤細(xì)胞集中、活力較好的部分。避免結(jié)締等正常組織。

Q：若是細(xì)胞中混成纖維細(xì)胞，如何去除？

A：成纖維細(xì)胞的去除對于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)十分重要。由于成纖維細(xì)胞貼壁速度較腫瘤細(xì)胞快，可利用反復(fù)貼壁法使二者分離，進(jìn)而達(dá)到清除成纖維細(xì)胞的目的。

Q：為什么離心后，沒有細(xì)胞分離出來？

A：需要考慮消化酶的因素，由于腫瘤組織較致密，胰酶無法消化，一般選用膠原酶，如膠原酶Ⅳ。若是組織十分致密可以再結(jié)合機(jī)械法，如研磨或者攪拌加速細(xì)胞分散。如下表為二者的區(qū)別：

注：膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細(xì)胞專用膠原酶，根據(jù)分離的組織類型需選擇合適的膠原酶類型。

Q：消化時間如何確定？

A：具體的消化酶的量和消化時間可根據(jù)組織類型和多少進(jìn)行調(diào)整。

Q：消化之前為什么用EDTA?

A：EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好。與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物后，形成的機(jī)械力可使細(xì)胞分散。

Q：細(xì)胞量太少，長不起來怎么辦？

A：有幾種辦法，如對沒消化完的組織塊反復(fù)消化，盡量多收集一些細(xì)胞；并且盡量傳代到小皿里，如6孔板都可以。若是細(xì)胞仍太少，應(yīng)耐心等待，盡量不要傳代，只換液。

Q：細(xì)胞難以貼壁？

A：盡快使接種的細(xì)胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。為了盡快促進(jìn)細(xì)胞貼壁，可以提前1h將千分之的明膠鋪于培養(yǎng)板。

Q：腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)方法與細(xì)胞系不同之處在哪里？

A：培養(yǎng)基一般選用RPM1640，DMEM等，建議最好能加入促生長的物質(zhì)：如胰島素、氫化可的松、雌激素、EGF等因子。

二、 原代正常組織分離

皮膚是人體最大的器官，但長久以來，表皮細(xì)胞一種被認(rèn)為是難以培養(yǎng)的細(xì)胞，限制了皮膚生物學(xué)基礎(chǔ)研究的發(fā)展。作為表皮的主要細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞已經(jīng)成為我們了解皮膚生物學(xué)至關(guān)重要的許多原創(chuàng)性研究的焦點(diǎn)。

下面就介紹下小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞的分離和培養(yǎng)?；具^程如下圖：

原代小鼠角質(zhì)細(xì)胞的分離步驟

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

分離出的小鼠角質(zhì)細(xì)胞

常見問題解答：

Q：皮膚組織作為正常組織，與腫瘤組織分離主要區(qū)別在哪里？

A：首先，皮膚組織需要用中性分離酶dispaseII將表皮分離出來；其次，在消化時，用的是胰酶，而非膠原酶，并且胰酶的濃度用的是0.05%，而不是0.25%。

Q：表皮的分離需要注意什么？

A：表皮一般可以完整的撕脫下來，溫度的變化，孵育的時間以及所用的酶的濃度都會影響表皮是否能完整剝離。

Q：為什么需要無Ca血清來終止消化？

A：因?yàn)镃a²⁺的濃度可以影響角質(zhì)形成細(xì)胞的生長，并且培養(yǎng)時必須嚴(yán)格調(diào)控培養(yǎng)基中的Ca²⁺濃度。

三、懸浮細(xì)胞分離培養(yǎng)

對于懸浮的原代細(xì)胞，如腹水或者胸水的癌細(xì)胞，可以直接低俗離心，將細(xì)胞洗滌幾次后置于合適培養(yǎng)基中。若是人為的骨髓或者外周血，則需要淋巴細(xì)胞分離液分層后再接種培養(yǎng)。