前言：病毒系統(tǒng)知識(shí)點(diǎn) get，四種主流基因轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒工具：腺相關(guān)病毒、腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒的區(qū)別優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用場(chǎng)景

隨著病毒生物學(xué)的發(fā)展，種類繁多的病毒載體已越來(lái)越成為向各種實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（如細(xì)胞系、原代細(xì)胞、組織臟器等）轉(zhuǎn)運(yùn)核酸的重要工具。除了在實(shí)驗(yàn)室的組織培養(yǎng)和動(dòng)物模型生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，它們還被用于治療遺傳性疾病的臨床試驗(yàn)中。目前主流的病毒載體系統(tǒng)主要包括慢病毒（LV）、（γ-）逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）、腺病毒（Ad）和腺相關(guān)病毒（AAV）。我們分述之。

慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒均屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科。其典型特征為其 RNA 基因組能逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 副本，cDNA 副本又能穩(wěn)定整合至宿主細(xì)胞基因組中（這就是常說(shuō)的穩(wěn)轉(zhuǎn)）。逆轉(zhuǎn)錄病毒通常分兩種：簡(jiǎn)單的（有時(shí)又稱為致癌病毒或γ- 逆轉(zhuǎn)錄病毒，如鼠白血病病毒）和復(fù)雜的（如慢病毒）。這些亞型間主要的差異在于復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒存在一些附屬基因和調(diào)控基因，而簡(jiǎn)單的則沒(méi)有（下文有進(jìn)一步的討論）。這兩類病毒顆粒都含有兩份正鏈 RNA，RNA 上附有病毒反轉(zhuǎn)錄酶（RT），它們位于病毒的內(nèi)核（圖 1）。位于內(nèi)核的還有結(jié)構(gòu)蛋白和酶，包括核殼（NC）、衣殼（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。內(nèi)核由一圈外周蛋白層包圍，外周蛋白包括基質(zhì)蛋白（MA），基質(zhì)蛋白又被來(lái)源于宿主細(xì)胞細(xì)胞膜插有包膜糖蛋白的腹膜所包圍 。

圖 1. 簡(jiǎn)單和復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子結(jié)構(gòu)。病毒顆粒含有兩份正鏈 RNA，RNA 上附有反轉(zhuǎn)錄酶（RT），它們位于病毒的內(nèi)核。除此之外，內(nèi)核還包含核殼（NC）、衣殼（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。內(nèi)核由一圈基質(zhì)蛋白（MA）所包圍，基質(zhì)蛋白又被來(lái)源于宿主細(xì)胞細(xì)胞膜插有包膜糖蛋白（ENV）的腹膜所包圍。圖片來(lái)源：漢恒生物

實(shí)驗(yàn)室常用的慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷1型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體。具有感染譜廣泛、可以有效感染分裂期和靜止期細(xì)胞、長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)，因此成為導(dǎo)入外源基因的有力工具?，F(xiàn)在慢病毒系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種細(xì)胞系的基因過(guò)表達(dá)、RNA 干擾、microRNA 研究以及活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。在整合宿主基因組過(guò)程中，逆轉(zhuǎn)錄病毒（比如 MLV）通常大約 20% 的感染事件發(fā)生在轉(zhuǎn)錄單位的 5' 端，對(duì) CpG 島和 DNase I 超敏感位點(diǎn)附近有一定的傾向性。而慢病毒載體多整合到遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的位點(diǎn)。因此，與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，慢病毒載體似乎致癌可能性較低，臨床應(yīng)用可能更安全。重組腺病毒（Adenovirus，Ad）載體系統(tǒng)是一種復(fù)制缺陷的腺病毒載體系統(tǒng)，在基因治療、基礎(chǔ)生命科學(xué)研究等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。重組腺病毒具有以下幾個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)：感染范圍廣，幾乎可以感染所有的細(xì)胞系、原代細(xì)胞和部分組織；感染效率高達(dá) 100%，全面超越其他病毒載體工具和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；對(duì)外源基因容載能力大（可以高達(dá) 8Kb）；不整合基因組；滴度高，操作方便。因此，重組腺病毒是最具有潛力的一種基因遞送工具。目前常用的腺病毒載體是基于人腺病毒 5 型（Ad5）的，其基因組是 36Kb 長(zhǎng)的線性雙鏈 DNA。腺病毒是通過(guò)自身的纖維（Fiber）和細(xì)胞表面的受體（如 CAR）結(jié)合被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，然后從內(nèi)吞體（endosome）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，借助細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)器啟動(dòng)病毒的復(fù)制組裝 (圖 2)。一個(gè)完整的病毒生活周期會(huì)引發(fā)細(xì)胞死亡從而釋放出病毒粒子。

圖 2. 腺病毒的基結(jié)構(gòu)與感染過(guò)程

目前最常用的腺病毒包裝體系有AdEasy和AdMAX兩種，其共同特點(diǎn)是目的基因（GOI）首先克隆到穿梭載體，然后再重組到腺病毒的大骨架上。這兩個(gè)系統(tǒng)均是腺病毒早期轉(zhuǎn)錄復(fù)制基因 E1 和 E3 缺陷的 (DE1, DE3)，其中 E3 基因?qū)Σ《井a(chǎn)生并非必需。因此，腺病毒包裝必需依賴表達(dá) E1 的細(xì)胞系，比如 HEK-293，HEK-293A 等。腺相關(guān)病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）屬微小病毒科 (parvovirus)，為無(wú)包膜的單鏈線狀 DNA 病毒。只有在腺病毒或者皰疹病毒等輔助病毒協(xié)助下，宿主才能產(chǎn)生具有感染性的 AAV，所以 AAV 被稱作腺相關(guān)病毒。典型的 AAV2 基因組約 4800bp 的單鏈 DNA- 被二十面體的外殼 -Capsid 包裹。AAV 的基因組包括 2 個(gè)反向末端重復(fù)序列 (ITR，145 bp) 和兩個(gè)讀碼框 (ORF)-Rep 和 Cap（圖 1）。ITR 對(duì)合成互補(bǔ) DNA 鏈?zhǔn)潜匦璧?；Rep 和 Cap 可以翻譯成多種不同蛋白，如 AAV 生活周期必需的 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40 以及包膜蛋白 VP1、VP2 及 VP3 等。

圖 3. AAV 基因組結(jié)構(gòu)與 Capsid（Cap）高頻突變位點(diǎn)示意圖。A. Capsid 晶體結(jié)構(gòu)示意圖。其中蛋白 VP1 表面不同顏色的氨基酸基團(tuán)代表 Cap 高頻突變位點(diǎn)。B. Cap 基因結(jié)構(gòu)。其中 Cap ORF 編碼 3 個(gè)蛋白 -VP1、VP2 和 VP3。高頻突變區(qū)域用不同顏色的箭頭表示，并對(duì)應(yīng)到圖 A 中 Cap 表面不同顏色的氨基酸基團(tuán)。C. AAV 基因組結(jié)構(gòu)。

需要著重提及的是，Capsid 表面一些關(guān)鍵的氨基酸殘基（圖 1A 中不同顏色的氨基酸）會(huì)與細(xì)胞表面的受體相互作用，介導(dǎo) AAV 病毒的特異性感染到目的組織或臟器。目前 AAV 有 12 種血清型、100 多種變體。不同的血清型對(duì)組織或器官有著不同的親和性（圖 4）。由于安全性高、免疫原性小、表達(dá)周期久等優(yōu)點(diǎn)，AAV 被稱為目前最適合在體研究（in vivo）基因功能的利器。

圖 4. 不同的 AAV 血清型對(duì)組織或臟器的偏愛(ài)性。

我們綜合比較下四種病毒載體系統(tǒng)的特點(diǎn)（表 1）：四種主流病毒載體系統(tǒng)的特點(diǎn)比較。

腺病毒與其他病毒工具比較，具有以下優(yōu)勢(shì)：a. 是研究原代非增殖細(xì)胞基因表達(dá)的最佳系統(tǒng)：腺病毒感染細(xì)胞后，1-2 天即可表達(dá)，是研究原代非增殖細(xì)胞基因表達(dá)的最佳系統(tǒng);b. 滴度高：腺病毒系統(tǒng)在轉(zhuǎn)有 E1 基因的 HEK293 細(xì)胞中可進(jìn)行自我復(fù)制，可產(chǎn)生滴度為1010 到1011PFU/mL 的病毒;c. 載體容量大：可容納不超過(guò)5kb 的片段;

d. 不整合到染色體中，無(wú)插入致突變性：腺病毒除卵細(xì)胞以外，幾乎在所有已知細(xì)胞中都不整合到染色體中，因此避免了因整合而引發(fā)的潛在的基因突變和隨機(jī)效應(yīng) 。

AAV在基因傳遞和表達(dá)的優(yōu)勢(shì)

1.宿主范圍廣：隨時(shí)可轉(zhuǎn)染的 AAV 可高效感染分裂和非分裂細(xì)胞；2.多種血清型 ：AAV1,AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 和 AAV9 等；3.安全性高：ITR 序列和 rep/cap 基因分別由獨(dú)立的質(zhì)粒表達(dá)；未發(fā)現(xiàn) AAV 對(duì)人體致 病，rAAV 去除了 wtAAV 基因組的96%，進(jìn)一步保證了安全性；4.免疫原性低：AAV2 的基因組僅 4681 個(gè)核苷酸，便于用常規(guī)的重組 DNA 技術(shù)進(jìn)行操作，而且進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)造成的免疫反應(yīng)??；5.擴(kuò)散性強(qiáng)：AAV可以穿透血腦屏障，是最理想的神經(jīng)元和膠質(zhì)神經(jīng)下感染工具。

腺相關(guān)病毒的局限性有哪些？

1. 體外實(shí)驗(yàn)表達(dá)水平較低：

主要是因?yàn)?rAAV 病毒的基因組是單鏈 DNA，在體外環(huán)境形成雙鏈并轉(zhuǎn)錄翻譯外源基因的效率非常低?？梢栽隗w外水平感染 rAAV 病毒的同時(shí)感染輔助病毒比如 Ad5 型腺病毒或者終濃度 10~50 mM 的丁酸鈉等方法提高細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的 rAAV 表達(dá)量。

2. 需較長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)始表達(dá)：

同樣是需要從單鏈 DNA 變成雙鏈 DNA，rAAV 在感染后需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)表達(dá)外源基因，所以 rAAV 感染后建議至少 1 周后做切片觀察。

3. 載體容量較?。?/p>

腺相關(guān)病毒載體作為基因治療的載體，目前最多只能容納4.7Kb外源DNA片段

慢病毒的優(yōu)勢(shì)：

1.慢病毒攜帶的基因組可整合到宿主基因組，使宿主細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)外源基因；

2.可感染分裂和非分裂細(xì)胞；

3.低免疫原性，直接注射活體組織不易造成免疫反應(yīng)，適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；

4.可以更換特異性啟動(dòng)子；

5.野生型的HIV大小約為9.8 kb，插入片段可長(zhǎng)達(dá)5-6 kb；