分子生物學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了基因相關(guān)技術(shù)在精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用，即將基因和基于基因修飾的細(xì)胞治療放在了醫(yī)療技術(shù)發(fā)展變革的最前沿，特別是對(duì)于目前尚不能滿(mǎn)足的醫(yī)療需求，這種新型治療技術(shù)的的潛力和重要性可與單克隆抗體相比。

但面對(duì)日益增加的市場(chǎng)需求，生物公司所面臨的挑戰(zhàn)也與日俱增，特別是基于病毒載體的治療策略。

基因和基于基因修飾的細(xì)胞治療方法是將治療性DNA注入患者細(xì)胞，以達(dá)到治療疾病的目的，包括體內(nèi)和體外途徑，其可用于替換或糾正錯(cuò)誤的基因，或編碼一個(gè)治療性蛋白。新DNA的導(dǎo)入可使用針對(duì)靶細(xì)胞的治療性轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，即通過(guò)直接或基于細(xì)胞的基因治療形式。

靶細(xì)胞遞送指將“包裝”后的載體導(dǎo)入原本“非許可”的細(xì)胞，其方法應(yīng)可在一定程度上增強(qiáng)治療效力，降低副作用。將基因治療產(chǎn)品遞送至目標(biāo)位點(diǎn)，需選擇合適的載體。基于載體的遞送方法可大體分類(lèi)為病毒或非病毒兩類(lèi)，理想的載體需具有一下特性：

· 嚴(yán)格控制的表達(dá)

· 低負(fù)作用

· 持續(xù)且可控的治療性作用

· 靶細(xì)胞特異性

· 負(fù)載容量

一些基因治療方法使用質(zhì)粒DNA（pDNA）作為非病毒基因遞送載體，其具有良好的安全特性、低毒性以及較大的基因負(fù)載，是病毒介導(dǎo)方法的有效補(bǔ)充，并兼容一系列的物理和機(jī)械遞送策略。但易受一些“生理性屏障”的限制，如腎清除、溶酶體攻擊以及血清內(nèi)切酶的降解。

多種機(jī)械和物理方法可用于將治療性基因遞送至其靶點(diǎn)，包括微注射、粒子轟擊、激光輻照、電穿孔、聲孔作用以及磁轉(zhuǎn)染等，各種方法都可在一定程度上將核酸遞送至靶細(xì)胞，且可避免病毒載體免疫原性相關(guān)的并發(fā)癥，但又各自存在其局限性，特別是對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響，此外，也缺乏對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量特性的控制。

如通常稱(chēng)為基因槍法的的粒子轟擊技術(shù)，其使用重金屬顆粒將特定的裸DNA質(zhì)粒導(dǎo)入靶細(xì)胞，該過(guò)程有賴(lài)于多種參數(shù)的優(yōu)化，包括顆粒的DNA載入、最終分布、遞送時(shí)間以及其它復(fù)雜因素，綜合優(yōu)化挑戰(zhàn)較大。而激光輻照方法指在特定光源條件下，靶細(xì)胞受影響的位點(diǎn)滲透性將增強(qiáng)，周?chē)h(huán)境中的基因穿過(guò)膜進(jìn)入細(xì)胞；電穿孔和聲孔作用分別指將細(xì)胞置于電場(chǎng)或超聲條件下，以在細(xì)胞膜上形成特定的“孔道”，使基因進(jìn)入，這幾種方法都存在一定的“隨機(jī)性”，較難進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化控制，也易影響細(xì)胞原本的特性。

所以，目前約70%的基因治療臨床實(shí)驗(yàn)都采用基于病毒載體的系統(tǒng)。

病毒作為基因遞送載體的優(yōu)點(diǎn)是量大，且已良好定性，特別適用于基因信息的轉(zhuǎn)化，所以其已成為臨床研究的焦點(diǎn)。病毒的天然生命周期可分為兩個(gè)不同的階段：感染和復(fù)制。前者指病毒基因組被宿主細(xì)胞攝入以及隨后的基因表達(dá)。用于基因治療時(shí)，需用含修飾基因組的治療性基因盒替換病毒基因組，然后導(dǎo)入靶細(xì)胞。

為保證治療的有效性，進(jìn)入細(xì)胞的治療性基因材料數(shù)量需精確控制，以與相應(yīng)疾病所呈現(xiàn)的特性相符。此外，遺傳性疾病的治療可能需要長(zhǎng)期的基因表達(dá)，而不是短期或瞬時(shí)的。為達(dá)到此作用，仔細(xì)選擇病毒載體是必要的前提。

腺相關(guān)病毒（AAV）和慢病毒在基因治療領(lǐng)域都有不少的適應(yīng)癥正在研發(fā)當(dāng)中。

直接基因治療或基于細(xì)胞的基因治療方法的第一步，都是將治療性轉(zhuǎn)基因包裝進(jìn)遞送載體，然后通過(guò)擴(kuò)增宿主細(xì)胞系，以達(dá)到足夠高的載體濃度。在直接基因的遞送中，治療性轉(zhuǎn)基因直接注入體內(nèi)目標(biāo)組織；基于細(xì)胞的基因治療要求分離并體外培養(yǎng)靶細(xì)胞，然后再對(duì)其進(jìn)行基因性修飾，經(jīng)擴(kuò)增并富集后，重新輸入患者體內(nèi)。

多種不同類(lèi)型的病毒可用于此目的，即將基因的功能性拷貝導(dǎo)入患者細(xì)胞?；诜遣≡訟AV的人細(xì)小病毒載體非常適合直接基因治療。AAV載體的特點(diǎn)是低免疫原性，即在直接體內(nèi)應(yīng)用中相對(duì)安全。荷蘭UniQure的阿利潑金是歐洲第一個(gè)商業(yè)化的基因治療產(chǎn)品，其即為攜帶人脂蛋白脂肪酶（LPL）基因的AAV1載體，可通過(guò)肌肉注射用于家族性脂蛋白脂肪酶缺乏癥（LPLD）。

病毒載體可感染用于細(xì)胞治療的分裂或非分裂細(xì)胞，其可基因性修飾靶細(xì)胞，包括T細(xì)胞或成熟細(xì)胞，以誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫功能或多能性。此應(yīng)用過(guò)程取決于兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：確定合適的治療性基因，并在維持其有效屬性前提下，將其成功遞送至目標(biāo)位點(diǎn)。

確定合適的治療性基因并維持其最適轉(zhuǎn)基因表達(dá)條件仍是基因治療中較大的挑戰(zhàn)，因?yàn)樾枰_的轉(zhuǎn)基因調(diào)節(jié)，以緩解不良效應(yīng)。有兩個(gè)關(guān)鍵基因元件可用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)：?jiǎn)?dòng)子和增強(qiáng)子。

啟動(dòng)子通常被分類(lèi)為基本型或誘導(dǎo)型的，功能可以是通用的或特定于某些組織的，其可啟動(dòng)特定基因的“基本性”連續(xù)或“誘導(dǎo)性”瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄。一般啟動(dòng)子具有穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄活性和高度的特異性，如黑素細(xì)胞特異性酪氨酸酶啟動(dòng)子，但也有啟動(dòng)子效率較低，需要一定程度的“增強(qiáng)”以支持其作用。

增強(qiáng)過(guò)程可通過(guò)多種方法來(lái)達(dá)到，包括去除“死亡”的無(wú)功能啟動(dòng)子區(qū)域、復(fù)制具有正向調(diào)節(jié)元件的位點(diǎn)、組合不同組織特異性啟動(dòng)子以及使用重組轉(zhuǎn)錄激活因子，以促進(jìn)DNA結(jié)合或反式激活等過(guò)程。當(dāng)確定合適的治療性基因后，其必需被有效遞送至靶細(xì)胞。

病毒載體的生產(chǎn)通?？刹捎脙煞N培養(yǎng)方式：橫向擴(kuò)展——基于“2D”平面技術(shù)的貼壁細(xì)胞；縱向擴(kuò)展——攪拌罐生物反應(yīng)器內(nèi)的“3D”懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。

對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)用于實(shí)驗(yàn)室目的的貼壁細(xì)胞系統(tǒng)在規(guī)模放大中會(huì)面臨很多困難。盡管滿(mǎn)足臨床應(yīng)用所需的病毒載體實(shí)際數(shù)量會(huì)有差別，但絕大部分項(xiàng)目都在從小規(guī)模操作向大規(guī)模設(shè)備轉(zhuǎn)移，而進(jìn)行工藝放大時(shí)，必需仔細(xì)考慮病毒的敏感性和穩(wěn)定性問(wèn)題。因?yàn)樵诋a(chǎn)量遞增過(guò)程中，剪切力、pH條件以及溫度等因素都會(huì)愈發(fā)重要。

慢病毒載體出現(xiàn)于90年代，作為γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的安全替代，慢病毒載體快速成為基因和基因修飾細(xì)胞治療的重要工具，因其可將基因插入到分裂和非分裂細(xì)胞。這類(lèi)載體被用于生產(chǎn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）和直接基因治療或免疫治療激活劑，成為再生醫(yī)學(xué)中的奠基性技術(shù)。

由于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方法的限制以及對(duì)慢病毒載體需求的增加，新的更大規(guī)模生產(chǎn)方法正逐步被使用，在常規(guī)的貼壁培養(yǎng)方式中，載體滴度已可達(dá)1.7x10^8-2.6x10^8vg/mL（每毫升病毒基因組）。但一般認(rèn)為，培養(yǎng)于大規(guī)模攪拌式生物反應(yīng)器的懸浮馴化細(xì)胞系更適合治療性產(chǎn)品的表達(dá)，因其更易規(guī)模放大，且不再需要使用額外的消化解離試劑。

腺病毒載體可使用人胚腎（HEK293）和人胚視網(wǎng)膜（PER.C6）細(xì)胞系生產(chǎn)。在日益增加的臨床需求驅(qū)動(dòng)下，腺病毒載體生產(chǎn)技術(shù)的優(yōu)化可有效幫助企業(yè)增加總生產(chǎn)量，提高效率。培養(yǎng)方式方面，貼壁細(xì)胞可使用固定床生物反應(yīng)器、平面式細(xì)胞工廠(chǎng)或基于微載體的培養(yǎng)技術(shù)。

但在工業(yè)上，更傾向于使用已懸浮馴化的細(xì)胞，其可成功生長(zhǎng)于無(wú)血清培養(yǎng)基，提高安全性，同時(shí)降低成本。此外，無(wú)血清懸浮培養(yǎng)操作更加直接，也更適于工藝規(guī)模放大至攪拌罐生物反應(yīng)器，以進(jìn)行百升至千升級(jí)規(guī)模的生產(chǎn)。

對(duì)于AAV的生產(chǎn)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的可獲得產(chǎn)量范圍為10^15-10^16vg，一般即為有效的基因治療范圍。但當(dāng)前的專(zhuān)利轉(zhuǎn)染技術(shù)已可超過(guò)這一數(shù)值，從而滿(mǎn)足更寬泛的臨床適應(yīng)癥或更高的劑量要求。如用于阿利潑金生產(chǎn)的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（BEVS），其感染sf9細(xì)胞，在>100L的生物反應(yīng)器中，產(chǎn)量可達(dá)到10^14-10^16vg/mL。相似的效果還見(jiàn)于用于5型腺病毒（Ad5）和簡(jiǎn)單皰疹病毒1（HSV-1）的HeLa和BHK-21細(xì)胞。

在下游工藝方面，特別是病毒純化，有一系列的方法可用于分離目的產(chǎn)物，并去除不需要的雜質(zhì)。但所有方法都必須針對(duì)不同類(lèi)型病毒載體的生理特性和表面特征進(jìn)行綜合考慮，但行業(yè)的總體趨勢(shì)是從傳統(tǒng)的技術(shù)，如超速離心，向更易操作和放大的超濾和層析技術(shù)轉(zhuǎn)移。

由于幾乎所有的產(chǎn)品都旨在人體的治療性使用，質(zhì)量控制（QC）和出廠(chǎng)檢測(cè)對(duì)于確保產(chǎn)品安全、純度和效力是必需的，但病毒載體的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性使得這方面的工作非常困難。

理想的檢測(cè)可用于提高生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和質(zhì)量，包括工藝導(dǎo)向的多個(gè)方面，如降低操作人員處理錯(cuò)誤的可能性、刪減開(kāi)放式手動(dòng)操作步驟、無(wú)縫的工藝流銜接、降低產(chǎn)品污染的幾率等。工藝控制結(jié)合多步工藝的簡(jiǎn)化可降低變異性，有利于QC和出廠(chǎng)測(cè)試的進(jìn)行，從而獲得符合CGMP要求的產(chǎn)品。