親愛的各位小伙伴，我們又見面啦~過去的一周，大家是不是沉浸在“追劇”的狂熱情緒中無法自拔了呢？

畢竟，《人民的名義》真的是好看又燒腦，引得廣大群群眾紛紛參與到熱烈的劇情討論中。

以至于小編上個(gè)微博，才剛摸到搜索欄還沒開始打字，就跳出了這樣的一串內(nèi)容：

撲朔迷離的劇情，各種潛在的可能性，不僅提高了這部劇的可看度，更調(diào)動了大家思考的積極性。其實(shí)，仔細(xì)想想，這跟平日里我們在實(shí)驗(yàn)室盯著“多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR”的反應(yīng)結(jié)果的模樣還真是挺像的~

在同一PCR反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)兩個(gè)或更多基因序列的擴(kuò)增和特異性檢測，隨之而來的是豐富的實(shí)驗(yàn)可能性，簡直不要太引人入勝~

那么，接下去，就讓我們來系統(tǒng)地了解一下“多重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR”吧~

▼

PCR 多重反應(yīng)是指在同一個(gè)反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)兩個(gè)或更多基因序列的擴(kuò)增和特異性檢測。要獲得成功，PCR 多重反應(yīng)必須能夠生成針對目的序列的足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物。多重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 可同時(shí)產(chǎn)生定性和定量的結(jié)果。對于多重?zé)晒舛?/span>PCR，所有的目的序列的擴(kuò)增必須能產(chǎn)生足夠的指數(shù)期信號。對于定性結(jié)果，如果擴(kuò)增產(chǎn)物足夠，也可利用終點(diǎn)檢測方法 (如凝膠電泳) 檢測所有目的序列。

后綴“plex”可用于多個(gè)術(shù)語。單重 (Singleplex) 反應(yīng)是一種旨在擴(kuò)增單個(gè)基因序列的分析。雙重 (Duplex) 反應(yīng)是兩個(gè)PCR 反應(yīng)的組合，旨在同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)基因序列。多重反應(yīng)最常見的類型是雙重反應(yīng)，它是在同一孔內(nèi)進(jìn)行靶基因和對照或標(biāo)準(zhǔn)品基因序列分析；多于兩重的更多重的反應(yīng)也是可實(shí)現(xiàn)的。

一些商品化的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒就是作為多重反應(yīng)進(jìn)行設(shè)計(jì)和驗(yàn)證的。例如，MicroSEQ? E.Coli O157:H7試劑盒采用了內(nèi)部陽性對照和大腸桿菌 靶點(diǎn)多重反應(yīng)。在研究應(yīng)用領(lǐng)域，通常由科學(xué)家來選擇采用哪種多重反應(yīng)分析，并負(fù)責(zé)多重反應(yīng)的驗(yàn)證。在考慮是否建立多重反應(yīng)分析時(shí)，權(quán)衡多重反應(yīng)與所需的驗(yàn)證工作的利弊至關(guān)重要。

多重反應(yīng)的三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：更高的通量 (每塊反應(yīng)板可分析更多樣本)、更低的樣本用量和試劑用量——取決于實(shí)驗(yàn)中的靶點(diǎn)數(shù)。例如，如果定量實(shí)驗(yàn)中只包括一個(gè)靶點(diǎn)分析，在同一反應(yīng)中加入標(biāo)準(zhǔn)品分析，如內(nèi)參，進(jìn)行雙重反應(yīng)靶點(diǎn)分析將提高2倍的通量，同時(shí)每個(gè)樣本減少一半的樣本用量和試劑用量。但如果定量實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)靶點(diǎn)分析，可將兩個(gè)靶點(diǎn)反應(yīng)與一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)組合成三重反應(yīng)。在這種情況下，樣本用量和試劑用量將進(jìn)一步降低。

如果同時(shí)進(jìn)行靶點(diǎn)和標(biāo)準(zhǔn)品多重反應(yīng)，則多重反應(yīng)還具有另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)——使加樣精度錯(cuò)誤最小化。同一孔的靶點(diǎn)和標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)來源于一次加樣，因此任何加樣精度錯(cuò)誤應(yīng)對靶點(diǎn)和標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果具有同等影響。為獲得精度優(yōu)勢，必須采用同一孔的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)對靶點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后計(jì)算技術(shù)重復(fù)的精度。比較利用單重反應(yīng)方式分析的數(shù)據(jù) (未經(jīng)過基于孔的標(biāo)準(zhǔn)化) 與利用多重反應(yīng)方式完成的分析，證明多重反應(yīng)的精度優(yōu)勢較大，具體取決于單重反應(yīng)的錯(cuò)誤。例如，對于單重反應(yīng)精度錯(cuò)誤極少的樣本，多重反應(yīng)的精度優(yōu)勢也微乎其微。

對于需要更高精度的定量實(shí)驗(yàn)，多重反應(yīng)的精度優(yōu)勢顯得尤為重要。例如，在拷貝數(shù)變異實(shí)驗(yàn)中，區(qū)分1拷貝基因與2拷貝基因是2倍差異，需要良好的精度。但區(qū)分 2 拷貝基因與 3 拷貝基因僅為1.5的差異，這需要更高的精度。對于此類型的實(shí)驗(yàn)，推薦采用多重反應(yīng)方法，其有助于達(dá)到該實(shí)驗(yàn)所需的精度。

多重反應(yīng)分析通常需要在同一孔內(nèi)加入多種染料。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀必須能夠準(zhǔn)確地檢測同一孔內(nèi)的不同染料信號。這些測量必須保持針對各染料的特異性，即便當(dāng)一種染料信號明顯高于其它信號時(shí)。

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 多重反應(yīng)的最佳熒光試劑是那些可以指定不同染料來檢測多重反應(yīng)中的各個(gè)基因序列的試劑。

絕大多數(shù)多重分析采用了多種染料、高特異性的試劑，如基于 TaqMan? 探針的 Assay。對于 RNA 多重反應(yīng)分析，我們一般推薦兩步法 RT-PCR，而非一步法 RT-PCR。一步法 RT-PCR 要求逆轉(zhuǎn)錄和 PCR的引物濃度相同，降低了多重反應(yīng)引物濃度的靈活性。而在兩步法 RT-PCR 中，可對 PCR 引物濃度進(jìn)行多重反應(yīng)優(yōu)化，且不會影響逆轉(zhuǎn)錄。

TaqMan? Multiplex Master Mix

TaqMan? QSY?探針引入了專利的不發(fā)熒光的3' QSY淬滅基團(tuán)，以便在多重檢測應(yīng)用中充分提高PCR性能，在為您帶來TaqMan檢測所固有的靈敏度和特異性的同時(shí)，給您的real-time PCR檢測設(shè)計(jì)又增添一把利器。新開發(fā)的QSY淬滅基團(tuán)可搭配FAM?、VIC?、ABY?和JUN?報(bào)告基團(tuán)染料進(jìn)行多重qPCR檢測。該QSY淬滅基團(tuán)不發(fā)熒光，可降低本底干擾，同時(shí)提升淬滅效果。

TaqMan? QSY?探針

采用TaqMan? QSY探針進(jìn)行多重檢測可以節(jié)省成本，減少樣品用量，同時(shí)還可以通過一次定量試驗(yàn)，獲得堪比4次單管反應(yīng)的結(jié)果。

單重反應(yīng)的結(jié)果與多重檢測的結(jié)果相近。擴(kuò)增圖顯示了4個(gè)EGFR探針進(jìn)行單重(藍(lán)色)和4重反應(yīng)擴(kuò)增的檢測曲線線性度比例，試驗(yàn)中每10μL反應(yīng)物依次采用了按比例稀釋的20,000 pg至2 pg參照克隆cDNA。

假定采用的是多染料實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 熒光試劑，則多重反應(yīng)中各種基因序列的檢測將需要不同的報(bào)告基團(tuán)染料。同一孔內(nèi)的報(bào)告基團(tuán)染料必須被實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀充分激發(fā)并準(zhǔn)確檢測。儀器生產(chǎn)商應(yīng)能夠提供推薦染料。請注意，Applied Biosystems? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 預(yù)混液中包含一種紅色的參比熒光染料。僅帶有藍(lán)色激發(fā)光的儀器可充分激發(fā)基于ROX?染料的參比熒光染料，但藍(lán)色激發(fā)光一般不足以激發(fā)用作報(bào)告基團(tuán)的紅色染料。

無需根據(jù)靶基因或基因產(chǎn)物的類型指定報(bào)告基團(tuán)染料，但遵循染料的指定模式可簡化多重分析的構(gòu)建。例如，F(xiàn)AM? 染料是 TaqMan? 探針中最常用的報(bào)告基團(tuán)染料。我們遵循其模式指定 FAM? 染料作為靶點(diǎn)分析的報(bào)告基團(tuán)染料，并指定 VIC? 染料作為標(biāo)準(zhǔn)品分析的報(bào)告基團(tuán)染料。采用此模式，可通過將不同的 FAM? 染料標(biāo)記的靶點(diǎn)分析與相同的標(biāo)準(zhǔn)品分析 VIC? 染料進(jìn)行配對，構(gòu)建多個(gè)雙鏈分析。進(jìn)行三重分析時(shí)，可將第三種染料 ABY? 或JUN? 染料與 FAM? 染料和 VIC? 染料相結(jié)合。請注意，如使用 ABY? 染料，則在同一孔內(nèi)不應(yīng)有 TAMRA? 染料存在，如果使用 JUN? 染料，MUSTANG PURPLE? 應(yīng)該作為參考標(biāo)準(zhǔn)取代 ROX? 染料。

多重反應(yīng) PCR 飽和是當(dāng)豐度更高的基因擴(kuò)增使熱穩(wěn)定性DNA 聚合酶飽和時(shí)，多重分析中可能出現(xiàn)的不良現(xiàn)象，它抑制了較低豐度基因的擴(kuò)增。飽和的補(bǔ)救措施是減少豐度更高的靶點(diǎn)的 PCR 引物的濃度，稱為“引物限制”。引物限制的濃度應(yīng)足夠?qū)崿F(xiàn)幾何擴(kuò)增，但需在 PCR 產(chǎn)物聚集到遏制較低豐度靶點(diǎn)擴(kuò)增之前使引物耗竭。計(jì)劃多重分析時(shí)，研究人員應(yīng)根據(jù) PCR 反應(yīng)中各基因和基因產(chǎn)物的 DNA 或 cDNA 絕對豐度，識別多重反應(yīng)中哪種基因或哪些基因有可能引起飽和。為此我們列出了三種最常見的雙鏈情景：

雙重反應(yīng)情景①

在這個(gè)最常見的情景中，所有樣本中豐度更高的基因或基因產(chǎn)物均相同。僅豐度更高的靶點(diǎn)分析需要引物限制。例如，標(biāo)準(zhǔn)品可能是 18S 核糖體 RNA，其占真核細(xì)胞總RNA 的 20%。每個(gè)樣本中 18S rRNA cDNA 的豐度高于任意mRNA cDNA。因此僅 18S 分析需要引物限制。

雙重反應(yīng)情景②

在本情景中，兩個(gè)基因在所有樣本中的豐度幾乎相同。一般而言，兩種基因的 Ct 差異為 3 或者更高，假定閾值相同，則認(rèn)為兩個(gè)基因的豐度不同。基因組 DNA 應(yīng)用領(lǐng)域 (如拷貝數(shù)差異) 最可能出現(xiàn)此情景。情景 2 無需引物限制，因?yàn)閮煞N基因幾乎同時(shí)經(jīng)歷幾何擴(kuò)增期。

雙重反應(yīng)情景③

在本情景中，基因或基因產(chǎn)物的豐度明顯高于其它。此時(shí)，兩種分析均應(yīng)為引物限制。 

影響多重分析性能的另一個(gè)潛在威脅是不同分析的引物間不必要的相互作用。引物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)會隨反應(yīng)中分析數(shù)目的增加而提高，因?yàn)殡S著多重反應(yīng)分析數(shù)的增加，出現(xiàn)的引物對的數(shù)目會隨之大幅增加。例如，在包含4個(gè)PCR 引物的雙重反應(yīng)分析中，可能有6種不同的PCR引物對，在包含6個(gè)PCR引物的三重分析中，則可能有 15 種不同的PCR引物對。在單重反應(yīng)中，每個(gè)分析可能都運(yùn)行得很好，但在多重反應(yīng)中，引物的相互作用可形成競爭產(chǎn)物，抑制擴(kuò)增的進(jìn)行。當(dāng)多重反應(yīng)分析具有同源性時(shí)，引物相互作用的幾率會提高。如果基于單重反應(yīng)與多重反應(yīng)的 Ct 值存在明顯差異的觀察得出存在引物的相互作用的現(xiàn)象，則補(bǔ)救措施是對之前的多重反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)采用不同的 Assay 進(jìn)行。