通常來講，real-time qPCR 的反應程序不需要像常規(guī)的 PCR 那樣，要變性、退火、延伸 3 步。由于其產物長度在 80～150 bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。

SYBR@Green 等染料法，最好在 PCR 擴增程序結束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷 PCR 產物的特異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認設置，或稍有不同，但都是一個在產物進行溶解時候，進行熒光信號的收集。

今天給大家匯總一下 qPCR 常見問題。文章底部還有更多詳細內容。

• 檢測熒光信號的步驟有誤：一般 SG 法采用 72℃ 延伸時采集，Taqman 法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。
  

• 引物或探針降解：可通過 PAGE 電泳檢測其完整性。

  
  

• 模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

• 模板降解：避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。

• 擴增效率低：反應條件不夠優(yōu)化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

• PCR 各種反應成分的降解或加樣量的不足。

• PCR 產物太長： 一般采用 80～150 bp 的產物長度。

  
  

• 加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度。
  

• 標準品出現(xiàn)降解：應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。

• 引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針。

• 模板中存在抑制物，或模板濃度過高。

• 引物設計不夠優(yōu)化：應避免引物二聚體和發(fā)夾結構的出現(xiàn)。

  
  

• 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

• 鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。

• 模板有基因組的污染：RNA 提取過程中避免基因組 DNA 的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。

• 反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

• 反應條件不夠優(yōu)化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。

• 反應體系中有 PCR 反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。

• 參比染料設定不正確：MasterMix 不加參比染料時，選 NONE。
  

• 模板的濃度太高或者降解。

• 熒光染料的降解。

按照正確的開關機順序操作，有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。

• 開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動后再開啟定量 PCR 儀主機，等主機面板上的綠燈亮后即可打開定量 PCR 的收集軟件，進行實驗。

• 關機順序：確認實驗已經結束后，首先關閉信號收集軟件，然后關掉定量PCR 儀主機的電源，最后關閉電腦。

CT 值與起始 DNA 濃度的對數(shù)成反比：

如果：不同管之間的 PCR 反應效率相同。這些 PCR 的反應效率接近 100%?？梢詮纳厦娴墓酵瞥鱿鄬浚?span>X01/X02） = 2 -ΔCT。假設實驗的目標是研究藥物處理后 0、24、48 小時 IL-2 基因在某種組織中的表達量的變化，所用內對照是18S RNA 基因。IL-2 和18S RNA 的測定結果都是 CT 值，而沒有通過標準曲線測定總 RNA 的 pg 數(shù)?！　?/p>

總的來說，有三個層次的校正是必須要做的。

• 參比信號校正。試劑中必須包含固定濃度的 ROX，這樣由于反應總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號波動都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映 PCR 進程。ROX 校正能夠極大地改進定量的精確度，提高重復管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。

• 內對照校正。實驗中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來自不同數(shù)目的細胞，所以將實驗結果校正到每個細胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如 IL-2）的同時定量一個內對照基因（如 18S RNA 基因），然后 IL-2/18S。內對照校正使不同樣品的實驗數(shù)據(jù)可以相互比較。

  
  

• 計算相對于基準樣品（Calibrator）的相對基因含量。比如研究處理和未處理的、0 小時和 6 小時的、正常和患病的之間的基因表達的差別，則需要計算處理/未處理、6 小時/0 小時、患病/正常。

  
  

一個辦法是運行背景校正反應板，當一個或多個反應孔連續(xù)顯示出不正常的高信號，則表明該孔可能被熒光污染物。

另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行 ROI 的校正，當某個孔的信號明顯高出其他孔時，則表明該孔被污染。

清除樣本加熱塊污染的步驟如下：

• 用移液器吸取少量乙醇并滴入每個污染的反應孔中。

• 吹打數(shù)次。

• 將廢液吸入廢液杯中。

• 重復以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。

• 確認反應孔中的殘留液體蒸發(fā)完。

  
  

是同樣可靠的。

內標的優(yōu)點在于目標基因與管家基因的反應條件最接近一致，缺點在于目標基因與管家基因的引物和探針相互之間會發(fā)生競爭與抑制，導致它們的 PCR 效率有差異。

外標的優(yōu)點在于目標基因與管家基因的引物和探針之間沒有發(fā)生競爭與抑制的機會，但是不同管之間的反應條件差異比同管的要大，也會導致它們的 PCR 效率有差異。

兩相比較，內標法與外標法的數(shù)據(jù)精確度是一樣的。

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