抗體治療方式被認(rèn)為是目前最為流行的重組蛋白治療方式?？贵w可以在細(xì)胞培養(yǎng)液中以可溶和較為穩(wěn)定地形式被高水平地表達(dá)。使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)均一的人源化抗體已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，而細(xì)胞的去除和發(fā)酵液澄清對(duì)于后續(xù)工藝的開(kāi)發(fā)具有非常重要的意義。

典型的發(fā)酵液澄清工藝

哺乳動(dòng)物的培養(yǎng)細(xì)胞很容易受到剪切力的影響，容易破碎從而釋放出蛋白酶和其他的宿主細(xì)胞蛋白，從而影響抗體的穩(wěn)定性和純度。此外，由于細(xì)胞培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，很容易染菌，從而造成蛋白和工藝設(shè)施的污染，所以處理時(shí)間對(duì)于細(xì)胞的去除和澄清也非常重要。離心和切向流過(guò)濾常被應(yīng)用于工業(yè)中去除細(xì)胞，最近幾年深層過(guò)濾的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。絮凝劑有時(shí)也被用來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞去除和離心的效果。除菌過(guò)濾一般用作色譜柱之前細(xì)胞去除和澄清的最后一步。當(dāng)前細(xì)胞去除和發(fā)酵液澄清的主要工藝結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1  大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵液的常見(jiàn)澄清工藝

第一級(jí)深層過(guò)濾，第二級(jí)深層過(guò)濾、除菌過(guò)濾

離心

工業(yè)上大多應(yīng)用Disk-stack離心去除細(xì)胞及其碎片。Disk-Stack離心可以連續(xù)離心，提高處理量，縮短處理時(shí)間。圖2為Disk-stack離心機(jī)的結(jié)構(gòu)。

在離心工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中，有很多參數(shù)需要優(yōu)化，如補(bǔ)料的速度、離心機(jī)轉(zhuǎn)速、濾餅層的去除頻率等，這些參數(shù)會(huì)影響到細(xì)胞的穩(wěn)定性、處理的時(shí)間以及抗體收率等?？捎猛ㄟ^(guò)優(yōu)化這些參數(shù)合理地使各種訴求達(dá)到平衡。

圖2  Disk-stack離心機(jī)結(jié)構(gòu)(courtesyofWestfaliaInc.)

(1)進(jìn)料，(2)排出口（輕相），(3)向心泵，(4)碟片，(5)儲(chǔ)渣空間，(6)排渣口，(7)排渣活塞閥，(8)離心捕集器，(9)排出口（重相），(10)噴嘴，(11)計(jì)量注水/開(kāi)啟水，(12)定時(shí)器.

切向流過(guò)濾

切向流過(guò)濾也和離心一樣被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞上清的收集。切向流過(guò)濾的優(yōu)勢(shì)在于一步就可以得到無(wú)顆粒的細(xì)胞上清，不需要額外的過(guò)濾步驟。但是在濾膜表明形成的濃縮極化層會(huì)嚴(yán)重影響膜的處理量，成為切向流過(guò)濾的一個(gè)主要問(wèn)題。此外，由顆粒引起的不可逆的膜堵塞會(huì)降低膜的使用壽命，成為另一個(gè)主要的問(wèn)題。目前有很多關(guān)于削弱濃縮極化層的研究，比如利用轉(zhuǎn)動(dòng)膜板來(lái)增大膜表面附近的流速，從而將濃縮極化層洗掉，還有一種方法是利用周期性地反沖洗來(lái)洗掉極化層。

對(duì)于切向流過(guò)濾系統(tǒng)而言，通量和收率是兩個(gè)必須要考慮的重要因素。通量決定著處理細(xì)胞發(fā)酵液所需要的膜面積，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。通量過(guò)高會(huì)加快膜的堵塞，降低膜的壽命，所以通量的優(yōu)化非常重要。膜的化學(xué)性質(zhì)和孔徑對(duì)于通量和可清洗能力也具有非常重要的決定性作用。此外，膜的載量即單位膜面積所處理的發(fā)酵液體積也是一個(gè)很重要的參數(shù)，需要深入優(yōu)化，膜的載量?jī)?yōu)化對(duì)工藝的放大具有非常重要的意義。

深層過(guò)濾

深層過(guò)濾指的是利用多孔介質(zhì)從流動(dòng)相中截留固體顆粒而不是表面截留，且一般介質(zhì)表面都帶有正電荷，可以通過(guò)靜電吸附的方式來(lái)攔截雜質(zhì)顆粒。原理如圖 3 所示。當(dāng)流體中顆粒較多時(shí)往往使用深層過(guò)濾。深層過(guò)濾介質(zhì)一般由纖維素或聚丙烯纖維柱床、過(guò)濾介質(zhì)（如硅藻土）和粘合劑（用于制作平整的界面）組成。由于離心不能完全去除細(xì)胞及其碎片，而切向流成本太高，所以深層過(guò)濾通常被用于離心之后，也可以單獨(dú)用于細(xì)胞發(fā)酵液的澄清。由于深層過(guò)濾介質(zhì)的孔徑并不均一，所以在深層過(guò)濾之后會(huì)緊接一個(gè)除菌過(guò)濾工藝，以利于色譜柱的純化。

圖3  深層過(guò)濾介質(zhì)的過(guò)濾機(jī)理

深層過(guò)濾工藝的開(kāi)發(fā)首先需要選擇過(guò)濾介質(zhì)，介質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)、孔徑、荷電性質(zhì)是需要重點(diǎn)考慮的因素。在選擇介質(zhì)的過(guò)程中，濾出液的濁度和過(guò)濾后介質(zhì)壓力差的升高將作為兩個(gè)重要的參數(shù)。另外一個(gè)選擇介質(zhì)的重要參數(shù)則是深層過(guò)濾之后再用除菌過(guò)濾的壓力差變化。3M的深層過(guò)濾產(chǎn)品如圖4所示，能提供從實(shí)驗(yàn)室小試、中試及大規(guī)模生產(chǎn)所需的不同尺寸的產(chǎn)品。

圖4 適用于不同規(guī)模的一體式深層過(guò)濾產(chǎn)品

對(duì)于細(xì)胞發(fā)酵液的澄清工藝，3M推薦的方案分別為單級(jí)深層過(guò)濾和雙級(jí)深層過(guò)濾兩種模式，可完全取代離心步驟，濾出液濁度小于10NTU，通量一般在100L/M2以上。具體選型方案如下圖5所示。

圖5 細(xì)胞發(fā)酵液澄清工藝

此外，3M還具有帶強(qiáng)電荷的ZB系列產(chǎn)品，可應(yīng)用于對(duì)DNA或HCP的去除有特定需求的澄清工藝。

絮凝作用

絮凝作用通過(guò)多種途徑是發(fā)酵液中的小顆粒變?yōu)榇箢w粒從而增強(qiáng)后續(xù)的過(guò)濾效果。絮凝劑通過(guò)吸附小顆粒形成大顆粒，減少了堵塞膜孔的小顆粒，同時(shí)降低了顆粒的可壓縮性，從而減小了濾餅層的過(guò)濾阻力。常用的絮凝劑有硅藻土和珍珠巖。但是向發(fā)酵液中加入這些土質(zhì)的材料，對(duì)于原核表達(dá)的產(chǎn)品可能沒(méi)有問(wèn)題，但是對(duì)于干凈的真核發(fā)酵液來(lái)說(shuō)，可能有應(yīng)用局限性。所以用深層過(guò)濾的方式固定這些材料常被用來(lái)澄清發(fā)酵液。

總結(jié)

合適的細(xì)胞去除和澄清的工藝單元取決于生產(chǎn)規(guī)模以及工藝設(shè)施。大規(guī)模工藝的發(fā)展使得細(xì)胞去除和澄清工藝中蛋白的收率達(dá)到98%以上。目前，離心已經(jīng)成為廣受青睞的細(xì)胞去除方式（大于2000L的規(guī)模），Disk-stack離心容易清潔而且比很多大型的切向流

裝置容易做無(wú)菌處理。但離心裝置的使用必然會(huì)需要發(fā)酵液的二次澄清過(guò)程，另外，需要提供相關(guān)的驗(yàn)證資料，維護(hù)成本也相對(duì)較高。深層過(guò)濾由于其工藝更容易放大，成本更低，處理周期短，且一次性深層過(guò)濾工藝由于其操作更加靈活、簡(jiǎn)便，現(xiàn)以被越來(lái)越多地生物制藥客戶所接受。（生物谷Bioon.com）