【摘要】

   通過片仔癀的HPLC研究、GC—MS研究?jī)煞N方法分析得出的典型峰對(duì)應(yīng)時(shí)間的特征色譜圖樣被用來標(biāo)定后續(xù)用于動(dòng)物研究和細(xì)胞培養(yǎng)的片仔癀樣品。

 通過片仔癀樣品的一系列小鼠試驗(yàn)可觀察到以下：

①   片仔癀具有保護(hù)肝臟，免受CCl4損害的能力。

②   組織剖學(xué)顯示CCl4能引起肝臟廣泛性壞死變化片仔癀能增加肝細(xì)胞中重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑的(表達(dá)因子)反應(yīng)元素的表達(dá)。暫時(shí)可以推斷片仔癀是影響這些傳遞信號(hào)途徑的能力而產(chǎn)生保肝作用。

【正文】

轉(zhuǎn)載自：《世界中醫(yī)藥》2007年8月第二卷增刊

作者：黃進(jìn)明 趙水連

    片仔癀主要含有三七、牛黃、麝香、蛇膽，用來治療肝病、癌癥和各種炎癥。最近我們研究了片仔癀治療四氯化碳引起的肝損傷效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

l材料和方法

    用于動(dòng)物和體外研究的片仔癀樣品的準(zhǔn)備：片仔癀從漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司得到并經(jīng)過鑒定。片仔癀樣品使用被預(yù)先處理成0.1g片仔癀粉溶于2ml雙重蒸餾水中的溶液。當(dāng)粉末完全溶解溶液變清時(shí)，樣品開始準(zhǔn)備灌服。在HPLC和GC-MS研究中，樣品分別溶于乙醚和乙醇中。

     片仔癀的HPLC研究：約2g的片仔癀樣品應(yīng)用索氏提取方法用150ml乙醚提取2h。濾去殘?jiān)?span>,溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去乙醚，殘?jiān)苡?span>10ml乙腈中。樣品通過SEP—PAKC18藥柱后，取20μL樣品注入HPLC設(shè)備，檢測(cè)設(shè)備是HP 1100型。測(cè)試峰是設(shè)在204nm。流動(dòng)相由32.5％的乙腈和67.5％ 0.1M  NH4H2P04組成，流速1.0ml/min 。

片仔癀的GC—MS研究：約0.5g片仔癀粉置于超聲波缸內(nèi)用4ml乙醇超聲波提取1h。分離上清液。溶劑用德國(guó)默克公司的分析純?cè)噭７治鰞x器用Helwlett—Packard的GCHP5890系列5973型分光光度計(jì)。色譜柱用的是帶厚度0.25μm膜的HP-5MS柱(30m±0.25mm)。氦氣作為載體，并且柱溫在200。保持15min。注射器和檢測(cè)器分別維持在230。和280。。主體選擇檢測(cè)器置于四極模式。

      實(shí)驗(yàn)小鼠組和對(duì)照小鼠組：在片仔癀+CCl4實(shí)驗(yàn)組中，ICR隨機(jī)抽取年輕成年小鼠(2~3月大)用灌胃法36h內(nèi)灌服0.5mg片仔癀/g體重3次，如：每12h灌服1次。第36h(灌服第3劑量片仔癀)，小鼠再腹腔注射2μgCCl4/體重。CCl4溶解于玉米油中(體積比1：1)。第48h，再灌服1次片仔癀。灌服最后一劑片仔癀后12h(即第60h)，小鼠以斷頸采血處死，并立即取出它們的肝臟，做為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)所用。在CCl4實(shí)驗(yàn)組，年輕成年小鼠用灌胃法灌服20μl蒸餾水以代替片仔癀，也是48h內(nèi)灌4次(如12h一次)。同樣第36h(或灌服第3劑蒸餾水時(shí))腹腔注射2μgCCl4/g體重。有三組對(duì)照組，在空白對(duì)照組中小鼠未作任何處理；在片仔癀對(duì)照組中小鼠只在48h內(nèi)灌服4次0.5mg片仔癀/g體重并灌服最后一劑量后12h處死；在溶媒對(duì)照組中，小鼠僅被腹腔注射0.2ml玉米油(CCl4的溶媒)并在注射后24h處死。每一實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都應(yīng)有至少20只小鼠。

     組織學(xué)的制備：第2天早晨，肝臟被切成中間、中央和側(cè)面部位。每部位再切成約1cm的3小塊，并立即在10％福爾馬林液中浸泡固定至少1天。接著這些組織小塊在一系列逐級(jí)上升的酒精中脫水，并隨后在二甲苯中清洗，再包埋于石蠟中用切片機(jī)切成5μm厚的切片。

    細(xì)胞核的計(jì)數(shù)：由蘇木素和伊紅染色過的切片在放大倍數(shù)400倍顯微鏡下觀察，可以明顯鑒別出正常細(xì)胞核和含有染色體凝聚碎片的異常細(xì)胞核。正常細(xì)胞核和異常細(xì)胞核的數(shù)量是由兩位獨(dú)立的觀察者計(jì)數(shù)，由聯(lián)接在一臺(tái)顯微鏡上的電腦上的運(yùn)行軟件“立體調(diào)查者”(MicroBrightField，Inc.，Colchester，VT，ΜSA)統(tǒng)計(jì)數(shù)目。每組至少隨機(jī)抽取10只小鼠，每只小鼠至少隨機(jī)抽取10個(gè)切片進(jìn)行細(xì)胞核計(jì)數(shù)。每個(gè)切片最好能由軟件隨機(jī)選取9~12個(gè)面積為100μm×100μm的計(jì)數(shù)區(qū)。每片切片計(jì)數(shù)區(qū)的數(shù)目(9~12個(gè))由軟件自動(dòng)最優(yōu)化選取。每實(shí)驗(yàn)組的異常細(xì)胞核的比例(異常細(xì)胞核的數(shù)目/總細(xì)胞核的數(shù)目×100％)隨即計(jì)算出來。

    肝功能的評(píng)價(jià)：血樣從空白組、CCl4組、片仔癀+CCl4組的小鼠得到。血樣在2000rpm離心10min，分離血清。ALT酶活性由InfinityTMALT試劑（Sigma，St．Loμis，MO，ΜSA)測(cè)試，由特殊分光光度計(jì)測(cè)量。

 細(xì)胞培養(yǎng)：肝細(xì)胞株(H358)從香港中文大學(xué)解剖系得到。細(xì)胞配成濃度2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml，后用聚L-賴氨酸包埋，接種于4孔的組織培養(yǎng)盤中。細(xì)胞維持在溶媒由Dμlbecco的變性伊格氏培養(yǎng)基+10％FBS組成的濃度為(0~1000)μg/ml的片仔癀溶液中，在5％的CO₂和溫度37℃中培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)72h培養(yǎng)后收集。在傳導(dǎo)信號(hào)描繪實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞被接種在96孔的培養(yǎng)盤中。

    細(xì)胞增殖分析：在(0~1000）μg/ml片仔癀溶液中培養(yǎng)的細(xì)胞在含有0.1％胰蛋白酶和1mM EDTA的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中37℃下溶解2~5min后從培養(yǎng)盤中分離出來。分離出來的細(xì)胞立即在2％冰的三聚甲醛PBS溶液中混合2h。流動(dòng)分析由Coμlter EPOCALTRA流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Beckman Coμlter)執(zhí)行。所有數(shù)據(jù)由EXPO V．2細(xì)胞計(jì)數(shù)器軟件和MODFIT軟件分析。

     SEAP報(bào)導(dǎo)器分析：片仔癀對(duì)肝細(xì)脆傳導(dǎo)作用的描述是由MercμryTM Pathway Pmfiling系統(tǒng)(Clontech)。增強(qiáng)元素：AP-1、NFκB、E-box、CRE、GRE和HSE。這些元素的作用是聯(lián)系TAL啟動(dòng)因子幫分泌堿性磷酸酶分析器(SEAP)。構(gòu)成物用LipofectAMI—NETM2000(LF2000，生物工程)。將混有50μl DMEM培養(yǎng)劑和0.4μl LF2000的300μg每一載體構(gòu)成物導(dǎo)入含有肝細(xì)胞的96孔培養(yǎng)盤的每一分室。24h后轉(zhuǎn)染物移走，加入新鮮的含有(0~500)μg/ml片仔癀的DMEM培養(yǎng)劑。經(jīng)48h培養(yǎng)，從96孔培養(yǎng)盤的每一孔中收集25μl上清液。一臺(tái)SEAP Detection KIT檢測(cè)儀被用來檢測(cè)上清液中堿性磷酸酶的濃度。所有分析在一個(gè)96孔平底微量滴定盤上進(jìn)行。每25μl上清液加入25μl稀釋緩沖液輕輕混合?；旌衔镌?span>65℃培養(yǎng)30min接著樣品中加人3μl 1mM  MUP，再培養(yǎng)60min。SEAP活性用一臺(tái)Victor-2 Multilabet(EG＆GWALLAC)計(jì)數(shù)器在360nm測(cè)量。作為正面操作，一些肝細(xì)胞用NFκB反應(yīng)元素轉(zhuǎn)染，接著用400ng/ml姜黃素處理。Singh&Aggarwal(1995)知道姜黃素能抑制NFκB轉(zhuǎn)錄活性。

2結(jié)果 

片仔癀樣品的標(biāo)定：片仔癀樣品用HPLC和GC-MS兩種方法分析。通過HPLC研究中波長(zhǎng)變化可以發(fā)現(xiàn)其吸收度最大是在204nm，因此用204nm作為色譜分析的波長(zhǎng)。HPLC色譜法在204nm顯示在滯留時(shí)間為2.043min、2.995min、3.717min、6.325min和15．709min有5個(gè)特征峰。在GC-Ms研究中也能得到典型的峰對(duì)應(yīng)時(shí)間的色譜圖樣。這些HPLC和GC—MS特征色譜圖樣被用來標(biāo)定后續(xù)用于動(dòng)物研究和細(xì)胞培養(yǎng)的片仔癀樣品。

    動(dòng)物研究：在空白對(duì)照組中小鼠未接受任何處理。肝實(shí)質(zhì)中的肝細(xì)胞排列在一厚的細(xì)胞網(wǎng)結(jié)平板上。肝細(xì)胞素從小葉中心靜脈向外輻射，兩個(gè)肝細(xì)胞索間有竇狀小管。在正常肝細(xì)胞只有1.2％細(xì)胞核出現(xiàn)異常。只處理過片仔癀的小鼠與正常肝臟有相似的結(jié)構(gòu)，異常細(xì)胞核的比例(3.7％)有輕微的增加。在網(wǎng)結(jié)平板中肝細(xì)胞排列在中心靜脈周圍，板間竇狀小管位置固定。然而在所有CCl4處理過的小鼠中，它們的肝臟在中央小葉地帶有明顯的組織學(xué)異常。在中心靜脈發(fā)現(xiàn)帶有異常細(xì)胞核的擴(kuò)散褪化細(xì)胞。許多這樣的細(xì)胞在離開小脈周圍地區(qū)的嗜酸物體時(shí)已將它們的細(xì)胞核擠出。因此，含有大多數(shù)嗜酸性物體和死細(xì)胞的粉紅色(嗜酸性)區(qū)域容易在中央小葉地帶觀察到。在其他區(qū)域許多肝細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)鼓起液泡。網(wǎng)狀的肝細(xì)胞平板結(jié)構(gòu)瓦解，竇狀小管毀壞或減少。細(xì)胞核的比例比起空白對(duì)照組和片仔癀組有明顯增加(P<0.01)。淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化并未發(fā)現(xiàn)。在片仔癀+CCL4組中正常肝組織部分恢復(fù)了。在許多肝小葉檢查中，中央靜脈周圍的粉紅色區(qū)域明顯減輕甚至全部消失，這表明CCL4引起的毒性大大降低了，異常細(xì)胞核的比例比起空白對(duì)照組和片仔癀組還是較高，但比起CCl4組卻明顯降低了(P<0.01)。在一些小脈周圍區(qū)域嗜酸物體還能找到。在一些小葉中部分肝細(xì)胞平板的網(wǎng)結(jié)結(jié)構(gòu)和竇狀小管得到恢復(fù)。小液泡還在一些肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可觀察到。對(duì)空白組、CCl4組和CCl4+片仔癀組小鼠的血樣的ALT水平進(jìn)行測(cè)量以測(cè)定片仔癀是否能保護(hù)小鼠肝臟避免四氯化碳引起的損害。正常小鼠血清的ALT值為179.3，而CCl4組的ALT值為1079.8。然而先喂食片仔癀后再用CCl4處理，ALT水平明顯降為684.0(P<0.05)

片仔癀對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響：我們研究過片仔癀對(duì)肝細(xì)胞增殖能力的影響，流程分析顯示，在沒有片仔癀的情況下，在G0/G1階段細(xì)胞平均數(shù)為(56±4)％，在S階段細(xì)胞平均數(shù)為(34±3)％，在G2/M階段細(xì)胞平均數(shù)為(10±3)％，結(jié)果與用(500~1000)μg/ml片仔癀處理過的細(xì)胞進(jìn)行比較，兩者未發(fā)現(xiàn)有明顯區(qū)別(P>0.05)。

片仔癀處理過的肝細(xì)胞傳導(dǎo)剖面分析：對(duì)片仔癀影響肝細(xì)胞中重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑的各種反應(yīng)元素的能力進(jìn)行了測(cè)試。調(diào)查研究了反應(yīng)元素中的AP1、CRE、GRE、HSE、E-box(Myc)、NFκB和NFAT的轉(zhuǎn)錄因子。片仔癀(500μg/m1)對(duì)E-box、GRE、HSE和NFAT反應(yīng)元素?zé)o明顯作用。然而與對(duì)照組(沒有加片仔癀的培養(yǎng)劑)比較，它刺激了AP1、CRE和NFκB反應(yīng)元素的增長(zhǎng)。每一試驗(yàn)重復(fù)4次。在所有例子中處理過片仔癀后AP1、CRE和NFκB轉(zhuǎn)錄活性與對(duì)照組比較有明顯增加(P<0.01)。

在陽(yáng)性對(duì)照組中，肝細(xì)胞通過NFκB反應(yīng)元素傳染且經(jīng)姜黃素處理。在所有3次重復(fù)試驗(yàn)中，姜黃素明顯抑制了NFκB活性(P<0.01)。

3討論      

這次研究中，我們觀察到片仔癀具有保護(hù)肝臟，免受CCl4損害的能力。組織解剖學(xué)顯示CCl4能引起肝臟廣泛性壞死變化。但在用CCl4處理之前給小鼠喂食片仔癀，這些壞死變化明顯減少了。異常細(xì)胞核比例及CCl4處理組的46.4％降到CCl4+片仔癀組的17.6％。這些結(jié)果表明片仔癀能保護(hù)肝臟，免受肝毒性物質(zhì)的損害。我們的肝功能水平測(cè)試也表明片仔癀能保護(hù)肝臟。我們發(fā)現(xiàn)CCl4處理后，血清的ALT酶活性處于高水平。相反，小鼠先喂食片仔癀后該指標(biāo)顯著降低了。片仔癀能增加肝細(xì)胞中重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑的(表達(dá)因子)反應(yīng)元素的表達(dá)。我們暫時(shí)可以推斷片仔癀是影響這些傳遞信號(hào)途徑的能力而產(chǎn)生保肝作用。