基于 HPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)的

甘草化學(xué)成分分析

趙艷敏¹，劉素香²，張晨曦¹，劉岱琳¹，張鐵軍^2*

1. 中國人民部隊(duì)武裝警察后勤學(xué)院 生藥與藥劑學(xué)教研室，天津  300309

2. 天津藥物研究院，天津  300193

摘  要：目的  采用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-Q-TOF-MS）對(duì)甘草 Glycyrrhiza uralensis 50%甲醇提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定。方法  Diamonsil II C18（250 mm×4.6 mm，5μm）反相 HPLC 梯度洗脫法分離各主要成分；電噴霧電離源經(jīng)正、負(fù)離子模式對(duì)色譜流出物進(jìn)行檢測，四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)各主要色譜峰進(jìn)行歸屬；選擇甲酸鈉溶 液為內(nèi)標(biāo)矯正。結(jié)果  通過二級(jí)高分辨質(zhì)譜分析結(jié)合對(duì)照品數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)，從甘草 50%甲醇提取物中共鑒定出 40 個(gè)化學(xué)成分，包括 28 個(gè)黃酮類、11 個(gè)三萜皂苷類和 1 個(gè)香豆素類化合物。結(jié)論  利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定甘草中的化合物并提供結(jié)構(gòu)信息，為快速分析甘草藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)提供可行方法。

關(guān)鍵詞：甘草；高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜；黃酮類成分；三萜類成分；香豆素類成分

中圖分類號(hào)：R284.1      

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A      

文章編號(hào)：0253 - 2670(2016)12 - 2061 - 08

DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.12.007

Analysis on chemical constituents from Glycyrrhizae Radix et Rhizoma by HPLC-Q-TOF-MS

ZHAO Yan-min¹, LIU Su-xiang², ZHANG Chen-xi¹, LIU Dai-lin¹, ZHANG Tie-jun²

1. College of Logistics, University of People’s Armed Police Force, Tianjin 300309, China

2. 2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China

Abstract: Objective  To analyze the main chemical constituents of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma by HPLC-Q-TOF-MS in the positive and negative ions mode. Methods  The chromatographic fingerprint was obtained with Diamonsil II C18 column (250 mm×4.6 mm, 5μm) and gradient elution with 0.05% H2O-formic acid (A)-acetonitrile (B), and the flow rate was 1 mL/min. The column temperature was maintained at 35℃. The detection wavelength was of 200?600 nm. Positive and negative ions MS information of Bruker Daltonics 1200 HPLC-Q-TOF was coupled with elemental analysis and compared with the literature data to analyze the compounds information. Results  Combined with the accurate relative molecular mass of compounds provided by HPLC-Q-TOF-MS, 40 compounds were identificated in the ethanolic extract from Glycyrrhizae Radix et Rhizoma, which include 28 flavonoids, 11 triterpenoids saponins, and one coumarin. Conclusion  The method provides the technical support for the quality control of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma, and contributes the reference data to elucidating the potential basis of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

Key words: Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; HPLC-Q-TOF-MS; flavonoids; triterpenoids; coumarin

 甘草 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma 是常用的傳統(tǒng)中藥，也是疏風(fēng)解毒膠囊的原料藥材之一，具有補(bǔ)脾益氣、潤肺止咳、緩急止痛、清熱解毒的功效^[1]，同時(shí)甘草在我國多個(gè)傳統(tǒng)經(jīng)典方劑中承擔(dān)著調(diào)和諸藥、緩和藥性的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示甘草具有抗?jié)?、解痙、抗菌、抗炎、調(diào)血脂、鎮(zhèn)痛和雌性激素樣作用等多種功效^[2]。甘草中的化學(xué)成分主要有三萜類、黃酮類、香豆素類和多糖類等^[2-5]，目前從甘草中分離鑒定的三萜類成分有60多種，黃酮類成分有100多種^[4]。甘草的化學(xué)成分比較復(fù)雜，而且由于品種和產(chǎn)地不同，其化學(xué)成分差異較大，因此建立一種微量、快速的定性識(shí)別方法，對(duì)于分析其作用物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要的意義。近年來應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用分析甘草中的化學(xué)成分取得一定進(jìn)展^[6-9]，有學(xué)者利用 HPLC/ESI-MSn 聯(lián)用方法對(duì)東北產(chǎn)甘草的化學(xué)成分進(jìn)行分析，根據(jù)多級(jí)質(zhì)譜（ESI-MSn）所得的碎片峰，結(jié)合紫外光譜、HPLC 的保留時(shí)間以及參考文獻(xiàn)報(bào)道共推測出 22 個(gè)化學(xué)成分的可能結(jié)構(gòu)^[8]。也有學(xué)者利用 HPLC-MS 的方法分析了炙甘草中的 38個(gè)化學(xué)成分^[9]。本實(shí)驗(yàn)在大量文獻(xiàn)工作的基礎(chǔ)上，利用HPLC-Q-TOF-MS方法分析了甘草的化學(xué)成分組成，首次在一個(gè)液質(zhì)條件下識(shí)別并鑒定了 40 個(gè)主要色譜峰的組成，其中包括 28 個(gè)黃酮類成分、11 個(gè)三萜皂苷類成分和 1 個(gè)香豆素類成分，為快速確定甘草的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支撐。

 1  儀器與試劑 

1200HPLC-TOF/MS（Bruker Daltonics），1200 HPLC（Agilent technology），Milli-Q 超純水系統(tǒng)（法國Millipore公司）。甲醇和乙腈（色譜純，美國Merck 公司），對(duì)照品甘草酸（批號(hào)731-9001）、甘草苷（批號(hào)111610201106）購自中國食品藥品檢定研究院，異甘草苷（批號(hào)J140320011）購自將來試劑公司，甘草素（批號(hào)FB-31001）購自上海永恒生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于 98%。甘草藥材購于內(nèi)蒙古億利能源股份有限公司甘草分公司，由天津藥物研究院張鐵軍研究員鑒定為烏拉爾甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的干燥根。

2  方法

2.1  對(duì)照品溶液配制

準(zhǔn)確稱量甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷對(duì)照品各2.00 mg，分別置于10 mL 量瓶中，加入適量50%甲醇溶解，并以50%甲醇定容，得到質(zhì)量濃度為200μg/mL對(duì)照品貯備液。檢測前利用 50% 甲醇溶液將對(duì)照品貯備液稀釋10倍，待測。

2.2  供試品溶液配制

取甘草粉末 1 g，加入 50%甲醇 20 mL置圓底燒瓶中，稱定質(zhì)量，超聲提取 30 min，冷卻后稱定質(zhì)量，并用 50%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻。經(jīng) 0.45μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。

2.3  色譜-質(zhì)譜條件

2.3.1  色譜條件  

色譜柱為 Diamonsil II C18柱（250 mm×4. 6 mm，5μm）；以 0.05%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～20 min，5%～25% B；20～30 min，25%～30% B；30～35 min，30%～35% B；35～45 min，35%～60% B；45～60 min，60% B；60～70 min，60%～70% B，體積流量為1.0 mL/min；柱溫35℃，進(jìn)樣量5μL；200～600 nm 全波長掃描。

2.3.2  質(zhì)譜條件  

分流比設(shè)為 1∶4，正負(fù)離子分別進(jìn)行全掃描（ESI），掃描質(zhì)量范圍 m/z 50～1 200； 干燥氣體的體積流量6 L/min，干燥氣溫度180℃，霧化氣壓80 kPa。正離子模式下，毛細(xì)管電壓 4500 V，負(fù)離子模式下的毛細(xì)管電壓2600 V，碎裂電壓70 V 選擇甲酸鈉溶液為內(nèi)標(biāo)矯正。甘草提取物的 HPLC-Q-TOF-MS 的總離子流圖見圖1。 3  結(jié)果與討論 

如圖 1 所示，在甘草50%甲醇提取液中通過 HPLC-Q-TOF-MS 檢測，正負(fù)離子流數(shù)據(jù)分析，共識(shí)別了41個(gè)色譜峰，通過質(zhì)譜裂解碎片分析并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)對(duì)照，鑒定了40 種化合物，包括 28 個(gè)黃酮類、11 個(gè)三萜皂苷類和1個(gè)香豆素類化合物，結(jié)果如表 1 所示。3.1  黃酮類化合物的分析鑒定

黃酮類成分是甘草藥材中的一類主要成分。本實(shí)驗(yàn)通過HPLC-Q-TOF-MS數(shù)據(jù)分析，結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)比共識(shí)別了 28 種黃酮類化合物，其中查耳酮類 5 個(gè)、二氫黃酮類 7 個(gè)、黃酮及黃酮醇類 6 個(gè)、異黃酮類 4 個(gè)、黃烷類 6 個(gè)。

3.1.1  二氫黃酮類化合物  

       5號(hào)峰的正離子質(zhì)譜中可以觀察到 441.126 8 [M＋Na] ，419.136 7 [M＋H] ，403 [M＋H －Glucose] ，271 [M＋H－Glucose－Arabinose] ，負(fù)離子質(zhì)譜中觀察到417.127 5 [M－H]?，根據(jù)元素分析結(jié)果綜合分析確定分子式為 C21H22O9。根據(jù)其裂解規(guī)律可以判斷結(jié)構(gòu)中存在 2個(gè)糖取代基。此外苷元部分的

裂解規(guī)律符合黃酮類化合物的裂解規(guī)律（圖2），且與對(duì)照品甘草苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律^[10]（圖3）完全一致，因此將 5號(hào)峰化合物鑒定為甘草苷。而 15 號(hào)峰的正負(fù)離子模式下分別給出了257.072 7 [M＋H] 和 256.070 2 [M－H]?，確定分子式為 C15H12O4。根據(jù)其極性，并與對(duì)照品甘草素的質(zhì)譜對(duì)照，確定 15 號(hào)峰是 5 號(hào)峰的苷元結(jié)構(gòu)，鑒定為甘草素。4號(hào)峰的質(zhì)譜信息正離子中可以觀察到 573.163 7 [M＋Na] 和 549.168 0 [M－H]?，分析確定其分子式 C26H30O13。根據(jù)其裂解碎片可以判斷其與 5號(hào)峰相比較僅多出了一個(gè)丟失芹糖基 m/z 132 的碎片峰，檢索文獻(xiàn)報(bào)道^[11]確定峰 4化合物為甘草素-4′-芹糖苷。

 7號(hào)峰的質(zhì)譜給出了正離子 505.135 3 [M＋H] ， 257 [M＋H－Glucuronide－acetyl] ，負(fù)離子503.127 3 [M－H]?，根據(jù)元素分析結(jié)果綜合分析確定分子式為 C24H24O12。參考文獻(xiàn)報(bào)道^[10]確定 7 號(hào)峰苷元與甘草苷的苷元相同，僅是連接的糖為糖醛酸，且 2 位被乙?；?，在質(zhì)譜裂解碎片中能夠觀察到脫去乙酰基的碎片峰。因此確定 7 號(hào)峰的結(jié)構(gòu)可能為 5-羥基甘草苷元-6′-乙酰基葡萄糖苷。

 8 號(hào)峰的質(zhì)譜給出了正離子 551.167 7 [M＋ H] ，負(fù)離子549.153 1 [M－H]?，綜合分析確定分子式為 C26H30O13。質(zhì)譜裂解規(guī)律中還可以觀察到419 [M＋H－Apiose] ，257 [M＋H－Apiose－Glucose] ，這些信息與 5 號(hào)峰非常相近，但是極性降低很多，說明其極性基團(tuán)減少，2 個(gè)羥基均被糖苷化，是一個(gè)雙糖連的結(jié)構(gòu)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道^[8]確定 8 號(hào)峰化合物為芹糖甘草苷。11號(hào)峰的質(zhì)譜裂解規(guī)律和分子信息與峰5非常接近，相對(duì)分子質(zhì)量和分子式相同，說明其與 5 號(hào)峰互為同分異構(gòu)體結(jié)構(gòu)。但二者極性相差較大，11 號(hào)峰出峰時(shí)間晚，結(jié)合文獻(xiàn)提供的化合物信息，將 11 號(hào)峰化合物確定為新甘草苷^[8]。

 29 號(hào)峰的正離子質(zhì)譜給出了m/z 357.167 5 [M＋ H] ，負(fù)離子質(zhì)譜中觀察到 m/z 355.153 2 [M－H]?，根據(jù)元素分析結(jié)果綜合分析確定分子式為 C20H20O6。結(jié)構(gòu)中有 RDA 裂解的碎片 m/z 153，說明 A 環(huán)中比 5 號(hào)峰多出 1 個(gè)羥基；在其質(zhì)譜的裂解碎片中有丟失 m/z 56 的碎片峰 m/z 301，說明 B 環(huán)中存在異戊烯基結(jié)構(gòu)，檢索文獻(xiàn)報(bào)道^[12-13]對(duì)比化合物信息確定 29 號(hào)峰化合物為烏拉爾寧。

3.1.2  查耳酮類化合物

 6 號(hào)峰的正負(fù)離子質(zhì)譜結(jié)合元素分析確定分子式為 C21H22O9。其相對(duì)分子質(zhì)量和分子式與 5 號(hào)峰完全一致，裂解的碎片與峰 5 也非常接近，但是出峰時(shí)間晚，極性低于峰 5，裂解峰的比例有差別，說明二者互為同分異構(gòu)體。6 號(hào)峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與對(duì)照品異甘草苷的質(zhì)譜數(shù)據(jù)完全一致，因此判斷 6 號(hào)峰為異甘草苷。16號(hào)峰的正負(fù)離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合元素分析確定分子式為 C15H12O4。其與 6 號(hào)峰相比較丟失了1 分子的葡萄糖基，檢索文獻(xiàn)報(bào)道^[8]確定 16 號(hào)峰化合物為異甘草素。

 9 號(hào)峰與 6 號(hào)峰相比較多 1 個(gè)芹糖基碎片，鑒于在二氫黃酮的分析鑒別中存在甘草苷和芹糖基甘草苷的一組化合物，結(jié)合文獻(xiàn)分析確定 9 號(hào)峰化合物是異甘草苷的芹糖基化產(chǎn)物，確定為異甘草苷-4′芹糖基。如表 1 所示，12 號(hào)峰的質(zhì)譜裂解碎片信息與 6 號(hào)峰非常接近，但是極性降低較多，借鑒二氫黃酮的鑒定過程，確定峰 12 化合物為新異甘草苷。                                 

 峰1 的極性最大，其正離子質(zhì)譜中可以觀察到 735.2 [M＋Na] ，負(fù)離子質(zhì)譜中觀察到711.2 [M－H]?，根據(jù)元素分析結(jié)果綜合分析確定其相對(duì)分子質(zhì)量為712，分子式為 C32H40O18。而且在質(zhì)譜的裂解過程中可以確定結(jié)構(gòu)中存在兩分子葡萄糖和 1 分子芹糖碎片。檢索文獻(xiàn)報(bào)道^[14]結(jié)合化合物極性分析，確定峰 1 化合物為異甘草苷元-7-O-芹糖-7, 4′-O-二葡萄糖苷。

3.1.3  黃酮和黃酮醇類化合物

 3號(hào)峰的正離子質(zhì)譜中可以觀察到 587.135 7 [M＋Na] ，565.160 8 [M＋H] ，403 [M＋H＋Glucose] ，271 [M＋H－Glucose－Arabinose] ，負(fù)離子質(zhì)譜中觀察到563.149 9 [M－H]?， 根據(jù)元素分析結(jié)果綜合分析確定分子式為 C26H28O14，該化合物的裂解過程說明其為二糖苷類化合物，結(jié)合化合物的極性并與文獻(xiàn)報(bào)道^[13]的化合物及其裂解規(guī)律相比對(duì)將其鑒定為夏佛塔苷。

 10 號(hào)峰的質(zhì)譜信息給出了 431.122 0 [M＋H] 和 475.112 3 [M＋HCOO]?，通過元素分析給出了分子式為 C22H22O9，與 5 號(hào)峰相比較，其極性弱于 5 號(hào)峰，且結(jié)構(gòu)中多出一個(gè)甲氧基結(jié)構(gòu)，由于 4′位連有糖苷鍵，因此推測甲氧基連接為 7 位，故將 10 號(hào)峰化合物確定為 7-甲氧基甘草苷。

 30 號(hào)峰的正離子質(zhì)譜中可以觀察到355.108 8 [M＋H] ，負(fù)離子質(zhì)譜中觀察到353.108 6 [M－H]?， 確定分子式為 C20H18O6。在質(zhì)譜信息中可以觀察到脫去 m/z 68 的碎片峰和發(fā)生 RDA 裂解的 m/z 221 的碎片峰，根據(jù)連有異戊烯基黃酮類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律^[13]可以確定異戊烯基連接在 A 環(huán)，結(jié)合文獻(xiàn)信息^[15]分析，確定 30 號(hào)峰化合物為甘草黃酮醇。

 27 號(hào)峰的質(zhì)譜信息與 29 號(hào)峰相比較極性較大， 通過對(duì)其正負(fù)離子中 393.108 8 [M＋Na] 和369.106 2 [M－H]?的分析確定分子式為 C20H18O7，根據(jù)其質(zhì)譜裂解過程確認(rèn)其與 29 號(hào)峰比較丟失了 2 個(gè)氫原子，但是多出了 1 個(gè)羥基取代，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道^[12]確定峰 27 為黃酮醇類化合物，結(jié)構(gòu)鑒定為烏拉爾醇。

 36 號(hào)峰極性非常小，通過分析其質(zhì)譜信息確定分子式為 C21H20O4，在質(zhì)譜信息中可以觀察到發(fā)生 RDA 裂解的 m/z 221 的碎片峰，對(duì)比甘草中報(bào)道的化合物^[16]確定其為異戊烯基與羥基發(fā)生環(huán)合使極性減小，為 5-甲氧基光甘草酮。

3.1.4  異黃酮類成分  

31 號(hào)峰、32 號(hào)峰通過正負(fù)離子信息以及元素分析后確定其分子式為 C20H18O6， 與 30 號(hào)峰互為同分異構(gòu)體，3 組峰的質(zhì)譜主要裂解信息都是相近的，但 31 和 32 號(hào)峰出現(xiàn)了異黃酮的特征碎片峰 m/z 205，因此和文獻(xiàn)對(duì)比確定 31 峰為異甘草黃酮醇，32 號(hào)峰為甘草寧 L ^[17]。按照相同的解析方法確定了 33 號(hào)峰的分子式為 C21H20O5，質(zhì)譜的裂解碎片中有丟失 m/z 56的碎片峰 m/z 297，說明結(jié)構(gòu)中存在異戊烯基結(jié)構(gòu)，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道確定33 號(hào)峰為甘草寧M ^[17]。34 號(hào)峰是 33 號(hào)峰的同分異構(gòu)體，也是異黃酮類結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)對(duì)照鑒定為甘草寧G ^[18]。28 號(hào)峰通過元素分析確定其分子式為 C21H20O6，其質(zhì)譜裂解信息與33 號(hào)峰非常接近，但是極性大于峰 33，發(fā)現(xiàn)該化合物結(jié)構(gòu)中多出一個(gè)羥基，結(jié)合文獻(xiàn)確定其為甘草寧N ^[16]。

3.1.5  黃烷類成分  

        黃烷類成分是甘草液質(zhì)分析中極性相對(duì)較小的一類成分。35號(hào)峰的正離子質(zhì)譜中給出了393.172 6 [M＋Na] ，負(fù)離子質(zhì)譜中給出了369.175 6 [M－H]?，元素分析確定分子式為 C22H26O5。在其正離子的質(zhì)譜裂解中可以觀察到 218，163的碎片峰，且 218 的碎片峰信號(hào)較強(qiáng)。通過文獻(xiàn)檢索在甘草中還存在 Kanozol 系列的黃烷類化合物^[19-20]。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量和化合物的極性確定 35 號(hào)峰化合物為 kanozol R，如圖 4 所示，218 的碎片峰是 C 環(huán)發(fā)生 RDA 裂解產(chǎn)生的碎片峰。

 根據(jù)同樣的方法，37 號(hào)峰和 39 號(hào)峰的相對(duì)分子質(zhì)量相同，分子式為 C26H32O5，該化合物與 35 號(hào)峰 相比多出了一個(gè)異戊烯基且與羥基發(fā)生環(huán)合反應(yīng)，質(zhì)譜裂解中主要出現(xiàn)的峰為 m/z 221 的碎片峰也是其 C 環(huán)發(fā)生RDA 裂解的產(chǎn)物，與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物 Kanozol H 的性質(zhì)相近。因此將 37 號(hào)峰和 39 號(hào)峰鑒定為 Kanozol H 及其同分異構(gòu)體。38 號(hào)峰與 37 號(hào)峰相比較為脫去了一分子羥基的結(jié)構(gòu)，故將 38 號(hào)峰鑒 定為 Dehydroxy Kanzonol H 及其異構(gòu)體。而 40 號(hào)和 41 號(hào)峰極性更小，分子式為 C26H30O5，其在 Kanozol H的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，另一側(cè)的異戊烯基也與羥基發(fā)生環(huán)合反應(yīng)，因此確定結(jié)構(gòu)為 Kanozol J 及其同分異構(gòu)體。

3.2  三萜皂苷類化合物的分析鑒定 

 三萜皂苷類成分是甘草藥材中的另一類重要成分。本文利用 HPLC-Q-TOF-MS 在指紋圖譜體系下共識(shí)別了11個(gè)三萜皂苷類化合物，均為甘草酸類衍生物。

 以 22 號(hào)峰為例闡述三萜皂苷類成分的裂解規(guī)律 和結(jié)構(gòu)鑒定的解析過程。該化合物的正離子質(zhì)譜中可以觀察到 m/z 823.405 7 [M＋H] ，負(fù)離子質(zhì)譜中給出了m/z 823.402 1 [M－H]?，綜合分析確定了其分子式 為C42H62O16。在正離子質(zhì)譜的碎片峰中可以 m/z 647 [M＋H－Glucuronide acid] 和 471 [M ＋H－Glucuronide acid×2] ，確定結(jié)構(gòu)中連接 2 個(gè)葡萄糖醛酸的結(jié)構(gòu)。470 應(yīng)該為苷元的相對(duì)分子質(zhì)量。之后又觀察到 m/z 304、262、206 和 175 的碎片峰。分析結(jié)構(gòu)可能是由于發(fā)生了麥?zhǔn)现嘏藕?/span>RDA 裂解產(chǎn)生的碎片。詳細(xì)裂解過程如圖 5 所示。苷元的結(jié)構(gòu)中由于 C-11 位羰基的存在，C-1 上又具有可轉(zhuǎn)移

的γH 原子，容易發(fā)生麥?zhǔn)现嘏?，并伴隨烯丙鍵（C7-C8之間）均裂，生成 m/z 303 碎片離子；麥?zhǔn)现嘏虐殡S C-1 上 1 個(gè) H 原子轉(zhuǎn)移也引起烯丙鍵 （C7-C8之間）均裂，生成的 m/z 304 離子也具有相 當(dāng)?shù)呢S度，繼續(xù)丟失 CH3及中性分子 C9H14O2生成 m/z 135（有時(shí)為基峰）。由于具有以上特征的裂解碎片峰，并和標(biāo)準(zhǔn)品甘草酸的質(zhì)譜裂解信息^[21]對(duì)比，將22號(hào)峰化合物鑒定為甘草酸。

 18、19、20 號(hào)峰的分子離子峰均比 23 號(hào)峰多出 m/z 16，且在質(zhì)譜裂解中脫糖的碎片峰是相同的，都具有脫去2分子糖醛酸的碎片峰，僅比苷元碎片多出 1 個(gè)脫掉 1 分子水（m/z 18）的碎片峰。因此可以確定苷元在甘草酸苷元的基礎(chǔ)上進(jìn)行了羥基化。因此離子流中 18、19、20 號(hào)峰均為甘草酸的 1 個(gè)羥基化的產(chǎn)物。同理，17 號(hào)峰在 1個(gè)羥基化產(chǎn)物的基礎(chǔ)上又多出了 1個(gè)m/z 16，且糖鏈裂解碎片也是一致的，僅苷元部分又多出了1個(gè)脫掉 1分子水的碎片峰，因此確定17 號(hào)峰為甘草酸 2個(gè)羥基化的產(chǎn)物。

 21 號(hào)峰的正離子質(zhì)譜中觀察到 m/z 809.436 8 [M＋H] ，633 [M＋H－Glucuronide acid] ，457 [M＋ H－Glucuronide acid×2] ，而負(fù)離子質(zhì)譜中可以觀察到 m/z 807.429 9 的負(fù)離子質(zhì)譜，從而確定該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為808.424 5，且元素分析確定其分子式為 C42H64O15。通過質(zhì)譜分析確定該化合物與峰 22 相比較，苷元部分缺少一個(gè)氧原子，且 RDA 裂解只獲得了289 碎片峰，說明三萜皂苷的C 環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，通過文獻(xiàn)報(bào)道比較^[20]，確定該化合物為的羰基被還原，鑒定為甘草皂苷B。

 13 號(hào)峰的極性在甘草皂苷中相對(duì)較大，其正離子中可以觀察到 m/z 825.424 4 [M＋H] ，649 [M＋H－Glucuronide acid] ，473 [M＋H－Glucuronide acid×2] ，而負(fù)離子質(zhì)譜中可以觀察到 m/z 823.423 6 [M－H]?，從而確定該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為 824.419 4，且元素分析確定其分子式為 C42H64O16。通過質(zhì)譜分析確定其苷元部分的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，出現(xiàn)了苷元 m/z 473的脫水峰 m/z 455，同時(shí)也出現(xiàn)了碎片峰 m/z 287，這是 C 環(huán)發(fā)生變化后得到的，而且與甘草酸的裂解規(guī)律相比較，m/z 304 的碎片峰改變?yōu)?m/z 287 說明開始的脫水反應(yīng)發(fā)生在 C 環(huán)，說明 C 環(huán)不存在羰基，羰基結(jié)構(gòu)被還原，這樣結(jié)合文獻(xiàn)的化合物信息^[12]，確定峰 13 為 11 位被還原的甘草酸的結(jié)構(gòu)，鑒定為 11-羥基甘草酸。26 號(hào)峰的陰正離子質(zhì) 譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與 13 號(hào)峰的元素組成完全相同，但是極性相差較大。且在質(zhì)譜的裂解碎片中，26 號(hào)峰的質(zhì)譜裂解中存在 289 的碎片峰，說明其化合物的 C 環(huán)與峰 21 的 C 環(huán)相近，不存在羰基結(jié)構(gòu)，并根據(jù)分析已經(jīng)獲得的甘草皂苷成分，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，確定 26 號(hào)峰是在 24 位進(jìn)行了羥基化，鑒定結(jié)構(gòu)為甘草皂苷J2。

 23、24 和25 號(hào)峰的正負(fù)離子對(duì)比分析，確定其 相對(duì)分子質(zhì)量和元素分析與峰 22 完全相同，均為C42H62O16。但其極性比甘草酸略大一些。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的化合物^[12,21]的極性和液相色譜中出峰的先后順序推測 23 號(hào)峰為烏拉爾甘草皂苷B，24 號(hào)峰化合物為甘草皂苷 H2，25 號(hào)峰化合物為甘草皂苷 K2。

3.3  香豆素類化合物的鑒定 

        15 號(hào)峰的質(zhì)譜中給出正離子 539.121 0 [2M＋H] ，269.082 4 [M＋H] ，負(fù)離子267.070 7 [M－H]?，根據(jù)元素分析確定了分子式為 C15H8O5。該化合物主要裂解峰為 m/z 146.9，是香豆素類化合物的主要裂解峰^[22]。參考甘草中分離化合物的文獻(xiàn)報(bào)道^[12]，結(jié)合化合物的出峰時(shí)間和裂解規(guī)律（圖 6），確定該化合物為甘草素。  

4  討論 

         本研究利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)甘草的化學(xué)成分進(jìn)行了分析鑒定，分析了 44 個(gè)色譜峰，鑒定了 40 個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的化合物，其中包括 28 個(gè)黃酮類類成分、11 個(gè)三萜皂苷類成分和 1 個(gè)香豆素類化合物。本研究首次在1個(gè)液質(zhì)條件下識(shí)別出了40個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的化合物，為甘草的全面質(zhì)量控制和其在復(fù)方中的配伍規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ)，并為甘草參與組方其他復(fù)方制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和成分分析鑒定提供了參考。

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