癌癥診斷會(huì)變得像血糖檢驗(yàn)一樣容易嗎？僅憑一管液體就可能使癌癥診斷、療效評(píng)估、實(shí)時(shí)監(jiān)控、個(gè)體化用藥變?yōu)榭赡埽?/p>

MIT Technology Review 公布的2015年度十大突破技術(shù)之一——液體活檢（liquid biopsy），以其簡單易行、靈敏特異、無創(chuàng)或微創(chuàng)，近來給傳統(tǒng)癌癥治療帶來顛覆性變革。

對(duì)于癌癥患者甚至普通的健康人群，這一技術(shù)到底意味著什么呢？（想知道結(jié)果的可以直接拉到文末）

首先需要了解液體活檢的概念和檢測(cè)對(duì)象。所謂“液體活檢”，即從血液、尿液、唾液等體液中捕捉游離的腫瘤核酸、囊泡、腫瘤細(xì)胞等，對(duì)疾?。ㄈ绨┌Y）的標(biāo)記物進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。 廣義液體活檢的對(duì)象主要包括三類：游離核酸、囊泡或完整的細(xì)胞，如圖所示[1]。

液體活檢的檢測(cè)對(duì)象

我們接下來將撰文對(duì)三類生物標(biāo)記物一一介紹。本文首先詳細(xì)介紹明星分子循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）。

ctDNA的發(fā)現(xiàn)史

早在1948年，Mandel和Metais就從正常人血液中檢測(cè)到游離的DNA 片段 （cell-free DNA, cfDNA）。1977年Leon等人發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)cfDNA含量明顯高于健康個(gè)體，而晚期腫瘤患者含量更高。隨著研究不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者的血漿和血清cfDNA中，存在與腫瘤基因改變相同的DNA片段，命名為ctDNA（circulating tumor DNA）[2]。

ctDNA的生物學(xué)特性

由于巨噬細(xì)胞等清道夫的清除作用，通常體液中游離核酸會(huì)被實(shí)時(shí)清除并保持極低含量，每一毫升血漿中，大約只有十幾納克（ng）的cfDNA。比如常規(guī)科研實(shí)踐采集10毫升的血液里，有約2萬細(xì)胞的cfDNA。但在腫瘤組織中，細(xì)胞代謝旺盛導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡和壞死，增加釋放游離核酸。

癌癥患者血液中含有突變片段的ctDNA占cfDNA比例0.01%~90%不等，ctDNA含量與腫瘤類型、腫瘤負(fù)荷和腫瘤進(jìn)展等相關(guān)。

一般來說，癌癥越晚期的病人，ctDNA的水平越高。片段化、低含量的ctDNA有一些獨(dú)有特征，如圖所示[3]。

ctDNA 的生物學(xué)特性

ctDNA的檢測(cè)技術(shù)

常用ctDNA的檢測(cè)分析方法包括：定量PCR，微滴數(shù)字式PCR, BEAMing，標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序方法, 癌癥個(gè)體化建檔深度測(cè)序分析方法，全基因組測(cè)序，全外顯子測(cè)序等。[4]

可以對(duì)ctDNA進(jìn)行定性分析，包括檢測(cè)基因突變、缺失、插入、融合、重排、拷貝數(shù)變異、甲基化、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）和雜合性缺失（LOH）等；也可以對(duì)ctDNA濃度進(jìn)行定量分析。定性和定量兩種方法均可以反映腫瘤的存在和嚴(yán)重程度。

超敏感ctDNA檢測(cè)技術(shù)CAPP-Seq

ctDNA的臨床應(yīng)用

傳統(tǒng)癌癥治療中，醫(yī)生通過手術(shù)或穿刺針取出腫瘤樣本，在顯微鏡下觀察病理組織切片并進(jìn)行遺傳學(xué)分析，做出診斷指導(dǎo)治療。這種方法具有侵入性和一定風(fēng)險(xiǎn)，而且比較昂貴。對(duì)于腫瘤演化產(chǎn)生異質(zhì)性和抗藥性，以及轉(zhuǎn)移期患者體內(nèi)存在多個(gè)腫瘤病灶，單次原位活檢存在很大局限。

液體活檢ctDNA通過低創(chuàng)無創(chuàng)的方式，讓病人擺脫傳統(tǒng)組織活檢的痛苦，實(shí)時(shí)多次獲取腫瘤基因組信息，大大提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，可能在臨床醫(yī)學(xué)有多方面應(yīng)用。

1術(shù)后判斷

通過檢測(cè)ctDNA水平評(píng)估手術(shù)效果，判斷腫瘤是否已經(jīng)切除干凈。

比如約翰斯霍普金斯醫(yī)學(xué)院的 Velculescu 等研究人員從101例II期胰腺癌患者同時(shí)收集腫瘤標(biāo)本和血液樣本，進(jìn)行全外顯子組測(cè)序。在接受腫瘤切除的早期胰腺癌患者中，如果檢測(cè)不到ctDNA說明手術(shù)成功預(yù)后較好，如果檢測(cè)到ctDNA，可能有殘留組織預(yù)后較差，更容易復(fù)發(fā)，兩組病人存在顯著差異。同時(shí)，與標(biāo)準(zhǔn)CT影像學(xué)相比，ctDNA可以提前6.5個(gè)月檢測(cè)到腫瘤復(fù)發(fā)[5]。

檢測(cè)ctDNA輔助術(shù)后判斷

2動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

以ctDNA作為腫瘤標(biāo)志物，多次取樣定性定量檢測(cè)腫瘤負(fù)荷，監(jiān)控疾病復(fù)發(fā)；同時(shí)還可以追蹤藥物響應(yīng)，通過藥物療效信息及時(shí)采取進(jìn)一步治療。

當(dāng)靶向藥有效時(shí)，ctDNA中藥物敏感的腫瘤特異突變減少，一旦產(chǎn)生耐藥，ctDNA中耐藥突變?cè)黾?。目前在肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥中都有報(bào)道。最經(jīng)典的案例之一是來自劍橋大學(xué)的研究人員對(duì)一名乳腺癌患者長達(dá)3年之久的追蹤研究。Muhammed Murtaza與同事對(duì)一名腫瘤擴(kuò)散至身體其它部位的乳腺癌患者，分別采集腫瘤樣本（活檢）和血液樣本，他們仔細(xì)對(duì)比了同一時(shí)間點(diǎn)采集的ctDNA和活體組織切片。血液樣本中的游離腫瘤DNA與活體腫瘤樣本測(cè)序結(jié)果相匹配，反映了當(dāng)腫瘤進(jìn)展和響應(yīng)藥物治療時(shí)的相同模式和遺傳變化，說明ctDNA可以時(shí)時(shí)監(jiān)控疾病情況，輔助調(diào)整治療方案[6]。

檢測(cè)ctDNA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤

3用藥指導(dǎo)

通過對(duì)ctDNA中腫瘤特異的突變檢測(cè)，能夠有效反映病人對(duì)治療的響應(yīng)。取治療前后的血漿樣本，對(duì)ctDNA測(cè)序鑒定藥物治療過程中產(chǎn)生的耐藥突變。

比如斯坦福大學(xué)Maximilian Diehn教授及其團(tuán)隊(duì)采用新研發(fā)的高敏感ctDNA檢測(cè)方法CAPP-Seq，分別對(duì)早、晚期非小細(xì)胞癌患者進(jìn)行檢測(cè)。1名VI期非小細(xì)胞肺癌患者在接受3個(gè)月化療治療后通過影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤縮小，同時(shí)ctDNA水平有所下降。但8個(gè)月后，患者ctDNA水平呈現(xiàn)升高，提示隱匿微小腫瘤病灶出現(xiàn)進(jìn)展。通過對(duì)ctDNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患者存在ALK融合基因，隨即使用 ALK融合基因靶向藥物克唑替尼進(jìn)行治療，患者病情得到很大改善，ctDNA水平也再次降低[4]。

檢測(cè)ctDNA指導(dǎo)用藥方案

4異質(zhì)評(píng)估

癌癥在病人體內(nèi)不斷分裂產(chǎn)生新的基因變異，進(jìn)化出藥物抗性使癌細(xì)胞繼續(xù)存活并增殖。ctDNA可以作為有效標(biāo)記物，評(píng)估腫瘤異質(zhì)性。

英國癌癥研究院的Isaac Garcia-Murillas博士團(tuán)隊(duì)，對(duì)55位以手術(shù)和化療為根治性治療的早期乳腺癌患者進(jìn)行ctDNA追蹤，在不同個(gè)體中，檢測(cè)到ctDNA的突變可能只出現(xiàn)在原發(fā)瘤或只出現(xiàn)在轉(zhuǎn)移瘤，也可能同時(shí)出現(xiàn)兩類腫瘤組織[7]。MuhammedMurtaza等用貝葉斯聚類方法PyClone對(duì)共發(fā)現(xiàn)的207個(gè)功能性突變進(jìn)行聚類，探索出三組主要腫瘤異種。一組突變主要發(fā)生在癌癥進(jìn)化早期，一組突變?cè)谒修D(zhuǎn)移性腫瘤樣本中存在高豐度，但在原發(fā)腫瘤中不易發(fā)現(xiàn)，還有一組突變具有相對(duì)多樣性，分散在不同時(shí)期的腫瘤活檢樣本中。血液樣本中ctDNA含有的隨機(jī)突變反映了腫瘤單克隆群的不同大小和活性，并揭示出腫瘤異質(zhì)性變化的順序[6]。

檢測(cè)ctDNA進(jìn)行異質(zhì)評(píng)估

ctDNA的更多進(jìn)展

除了研究血液中的ctDNA，科學(xué)家也在積極探索腦脊液ctDNA作為腦腫瘤液體活檢標(biāo)志物克服血腦屏障影響[8]，另有最新報(bào)道肺癌患者唾液中ctDNA呈現(xiàn)與血液ctDNA相近的檢測(cè)效果[9]。美國公司trovagene堅(jiān)持多年燒錢探索樣源豐富的尿液循環(huán)腫瘤DNA標(biāo)記物等等。ctDNA檢測(cè)已獲得一些臨床和相關(guān)機(jī)構(gòu)認(rèn)可，比如歐盟和中國藥品監(jiān)管局先后于2014年、2015年批準(zhǔn)阿斯利康易瑞沙（Iressa）血液ctDNA伴隨診斷，用于篩查腫瘤組織不可評(píng)估的患者人群。 [10]

不僅臨床科研領(lǐng)域ctDNA在癌癥篩查和監(jiān)測(cè)等多個(gè)層面發(fā)展迅速，諸多企業(yè)也紛紛涌入開拓市場(chǎng)。連世界著名基因測(cè)序儀巨頭Illumina也按捺不住，2016年初組建新公司Grail（圣杯）加入液體活檢領(lǐng)域，專攻ctDNA在早期腫瘤檢測(cè)中的應(yīng)用，吸引蓋茨基金、亞馬遜創(chuàng)始人杰夫·貝佐斯等多家資金約1億美元投資（要跟土豪交朋友?。?。

介紹了這么多，ctDNA在腫瘤檢測(cè)、評(píng)估、用藥中有如此神奇的威力，大家肯定很關(guān)心：

健康人群有必要做ctDNA檢測(cè)嗎？且慢??！

盡管潛力巨大，目前ctDNA還無法成為臨床上的主要診療手段。

· 早期癌癥ctDNA檢測(cè)難度大。

即使采用超敏感的CAPP-Seq，ctDNA在II-IV期的非小細(xì)胞肺癌患者NSCLC中檢測(cè)敏感性100%，而I期的NSCLC中敏感性僅為50%[4]。與之類似，在近十種640例癌癥患者中的研究也報(bào)道，47%的I期癌癥患者、55%的II期癌癥患者、69%的III期癌癥患者以及82%的IV期癌癥患者可檢測(cè)到血液中ctDNA[10] 。也就是說在腫瘤早期篩查方面，僅通過檢測(cè)ctDNA來診斷癌癥的患病風(fēng)險(xiǎn)還有很長的道路要走。

· 不同腫瘤組織中，ctDNA的含量差異很大。

比如在Bettegowda的研究中，只有不到50%的髓母細(xì)胞瘤、轉(zhuǎn)移性腎癌、前列腺癌或甲狀腺癌，以及不到10%的膠質(zhì)瘤患者可以檢測(cè)到ctDNA，而在超過75%的晚期胰腺癌，卵巢癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌以及頭頸癌可以檢測(cè)到ctDNA[11]。

不同腫瘤組織ctDNA含量差異大

· 檢測(cè)結(jié)果參差不齊。

ctDNA檢測(cè)方法需要加強(qiáng)流程規(guī)范。包括前期血液處理過程和提取cfDNA方法標(biāo)準(zhǔn)化，提高檢測(cè)的可重復(fù)性。

· 臨床實(shí)踐依然昂貴。

特別是采用更為有效和全面的二代測(cè)序技術(shù)，目前價(jià)格還比較昂貴，有待進(jìn)一步降低循環(huán)腫瘤核酸的檢測(cè)成本。

小結(jié)

ctDNA檢測(cè)：

· 臨床優(yōu)勢(shì)：無創(chuàng)無損，靈敏特異，實(shí)時(shí)多次，廣泛全面

· 臨床應(yīng)用：術(shù)后判斷，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，用藥指導(dǎo)，異質(zhì)評(píng)估

盡管ctDNA檢驗(yàn)技術(shù)還有待成熟，需要盡快建立統(tǒng)一的臨床標(biāo)準(zhǔn)，正如加州大學(xué)舊金山分校瘤遺傳學(xué)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人John Witte所說：“重要的是要保持良好的懷疑態(tài)度”。利用精確特異的ctDNA檢測(cè)，幫助醫(yī)生像偵探一樣敏銳監(jiān)控癌癥進(jìn)展，跟蹤抗性突變，及時(shí)指導(dǎo)用藥方案。

“將癌癥從一種致命疾病轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N慢性病還有多遠(yuǎn)？”

道路是曲折的，前途是光明的，讓我們共同拭目以待吧。

【作者簡介】李妙竹，博士就讀中科院上海生命科學(xué)院，師從遺傳學(xué)家賀林院士。目前在杜克大學(xué)做人類基因組數(shù)據(jù)分析，系統(tǒng)性探索衰老和長壽的奧秘。

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