近年來，隨著山區(qū)開礦和城鎮(zhèn)建沒使木耳物種的數(shù)目日益減少，對木耳種質(zhì)資源的收集、保存及研究成為一項(xiàng)必不可少的基礎(chǔ)工作。而一株優(yōu)良的木耳菌株經(jīng)過多年的擴(kuò)大生產(chǎn)使用，其優(yōu)良特性會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的退化現(xiàn)象，也必須進(jìn)行重新分離復(fù)壯， 為了保證木耳產(chǎn)業(yè)的正常發(fā)展，不間斷地選育優(yōu)良菌株勢在必行。傳統(tǒng)的選育菌種大多是通過組織分離方法，多用鮮耳直接分離或?qū)⒏啥盟轁窈笤俜蛛x。目前也 有采用干耳進(jìn)行分離的，但程序繁雜，所用藥品較多，條件差的地方難以做到。由于受多種藥物的作用，即使分離成功，菌絲萌發(fā)和生長也很緩慢。黑木耳的 耳瓣薄，并富有膠質(zhì)，所以在過去的分離法中很少采用耳片組織分離。本方法克服現(xiàn)有的干耳菌種分離方法中所存在的操作復(fù)雜、成本高、菌絲分離成功率較低、質(zhì) 量差等缺陷，是一種操作簡單，用材少（包括藥品），成本低，菌絲萌發(fā)快，長勢強(qiáng)，濃密，分離成功率高的干耳組織分離方法，以解決木耳的常規(guī)分離法所存在的 一系列技術(shù)問題，為廣大制種工作者提供方便。

　　1　供試材料

　　1.1　耳片來源

　　2008年將從江西省分宜縣大崗山、海南省陵水縣吊羅山、海南省昌江縣霸王嶺、重慶市重慶師范大學(xué)、湖北省武漢市黃鶴樓景區(qū)、河北省淶水縣北辛莊等野外采集的黑木耳[Auricularia auricula（L.ex Hook.）Underw.]、毛木耳［Auricularia polytricha（Mont.）Sacc.]及皺木耳（Auricularia deli～cata（Fr.）Henn.）標(biāo)本帶回室內(nèi)自然陰干或于28℃的烘箱烘干，干燥后即可用于組織分離菌種。

　　1.2　培養(yǎng)基制備

　?、?、分離培養(yǎng)基：麥芽浸粉20g，瓊脂18g，水1000mL，pH自然。將分離培養(yǎng)基煮好后趁熱分裝于5mL的離心管中，裝液量為1.8mL，裝于離心管架上，于121℃高壓滅菌20min，滅菌后將離心管架傾斜擺放使培養(yǎng)基成一斜面?zhèn)溆谩?/p>

　?、凇⒓兓囵B(yǎng)基：麥芽浸粉20g，葡萄糖20g，瓊脂18g，磷酸二氫鉀3g，水1000mL，pH自然。將純化培養(yǎng)基煮好后趁熱裝于 500mL的三角瓶中，用牛皮紙封口后于122℃高壓滅菌20min。滅菌后趁熱移至無菌超凈工作臺，分裝于60gm×1.3cm的平皿中，裝液量為 13mL，將平板水平擺放，待培養(yǎng)基冷卻后備用。

　　2　組織分離方法

　　2.1　材料準(zhǔn)備　挑選朵型大、肉質(zhì)厚、無筋或少筋、顏色正、無霉、無蟲害野生或栽培的當(dāng)年頭茬干木耳1片放入無菌超凈工作臺內(nèi)。每號標(biāo)本準(zhǔn)備10管斜面培養(yǎng)基。

　　2.2　用具準(zhǔn)備　組織分離所用工具為剪刀和鑷子，使用前在酒精燈火焰上方消毒即可。

　　2.3　組織分離及純化培養(yǎng)

　　2.3.1　干木耳消毒并潤濕　在超凈工作臺內(nèi)將干耳片表面用75%酒精棉球擦拭2～3遍，用酒精棉包住耳片約2min。

　　2.3.2　剪取耳片組織塊　用無菌剪刀將耳片四周邊緣去掉，剪取遠(yuǎn)離耳基沒有筋的最平部位的耳片，得到長0.5cm左右，寬0.2cm左右的組織塊。

　　2.3.3　組織塊滅菌消毒　用無菌鑷子夾取該組織塊在酒精燈火焰的外焰上方來回快速穿梭2～3次，每次1～2s。

　　2.3.4　分離培養(yǎng)　將組織塊的1/3～1/2部位插入5mL離心管中的斜面分離培養(yǎng)基的中下部位之中；上述整個(gè)過程都要遵循無菌操作。將接種后的離心管插入離心管盒中（32管/盒），置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　2.3.5　純化培養(yǎng)　分離培養(yǎng)5～6d后，挑取新生長出的菌絲作為接種塊接種于純化培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)。

　　3　結(jié)果與討論

　　組織分離2～3d后，長勢旺盛的可看到白色絨毛狀菌絲，分離成功率達(dá)95%以上。在用干耳組織分離過程中若出現(xiàn)污染也只是細(xì)菌污染，幾乎沒有霉菌污 染，因此可在分離培養(yǎng)中添加100ug/mL的青霉素鈉來增強(qiáng)培養(yǎng)基抗細(xì)菌污染的能力”。另外，轉(zhuǎn)管時(shí)如不慎，挑取了染有細(xì)菌的菌落，轉(zhuǎn)管后幾天內(nèi)細(xì)菌長 勢較旺，無法純化菌絲。因此轉(zhuǎn)管時(shí)應(yīng)將接種塊插入培養(yǎng)基（最好用平板）內(nèi)部，接種塊露出培養(yǎng)基表面1/3即可，這樣細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長，待其長出表面時(shí)菌 絲的生長勢已明顯強(qiáng)于細(xì)菌，培養(yǎng)1周左右待菌絲長到無菌區(qū)再次轉(zhuǎn)管可獲得純菌絲。

　　試驗(yàn)采用的純化培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，較適合木耳菌絲的生長，接種于60cm的平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)條件下生長勢最強(qiáng)的菌絲6d就可長滿平 板，獲得大量的木耳純菌絲，菌絲生物量鮮重最高達(dá)到176.9mg/13mL，干重為70.8mg/13mL，長勢中等的需10d，長勢較弱的需10d以 上長滿平板。

　　此方法與傳統(tǒng)的木耳組織分離方法相比主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：

　　①、方法簡便，節(jié)省材料，只需一小片耳片就能成功分離出所需菌種，又能較穩(wěn)定地保持原有菌種的優(yōu)良特性。

　?、?、分離效率高，操作時(shí)間短，不需要用酒精或升汞等長時(shí)間浸泡處理木耳耳片，只需要將干木耳的表面用75%酒精棉球擦拭2～3遍，用酒精棉包住 耳片約2min，然后將耳片組織塊從酒精燈火焰的外焰中快速的來回穿梭2～3次，就能在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到徹底消毒的效果。而現(xiàn)有的木耳組織分離方法中多是 采用升汞進(jìn)行消毒處理，升汞對周圍環(huán)境有害，對木耳也有一定的不利影響，用升汞消毒后需要用清水進(jìn)行反復(fù)沖洗；但是干木耳如果潤濕過度，將其剪成耳片組織 塊后，由于缺乏硬度和韌性，無法將其順利插入到分離培養(yǎng)基中并保持豎立，結(jié)果造成分離成功率非常低。

　　③、耳片經(jīng)曬干已殺滅部分雜菌，經(jīng)上述再處理，消毒較為徹底，組織塊接種在母種培養(yǎng)基上時(shí)，很快吸收無菌水分、使耳片膨脹恢復(fù)萌發(fā)菌絲能力，分離成功率高達(dá)95%以上（常規(guī)分離法最高的分離成功率僅為80%左右），菌絲生物量高。

　　方法操作簡捷，生產(chǎn)成本低，菌種分離成功率高，菌絲萌發(fā)快、長勢強(qiáng)、濃密，適用于野生及栽培的黑木耳、毛木耳或皺木耳等多種膠質(zhì)耳的組織分離，應(yīng)用范圍較廣。