DDD. 用的是Santa Cruz的抗體，也實驗過一抗和二抗肯定能結(jié)合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍染色沒問題，但是不知道與Marker對應(yīng)的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時轉(zhuǎn)膜后，麗春紅染色發(fā)現(xiàn)大分子量蛋白轉(zhuǎn)過去的較少。難道是裂解液出了問題？我用的是三去污劑，但沒加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解 -80度凍存的細胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克?。ǖ诙妫┥系募訕觔uffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。不知道是哪里出了問題？
解答：建議：1、首先確定您提的蛋白質(zhì)量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測蛋白的濃度，一般來講，其濃度應(yīng)該在幾-20微克/微升。
2、若是蛋白沒問題，哪就看是不是電泳的問題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10％和12％的膠。60-80V，1小時左右。跑過積層膠與分離膠的線時，換用100V，3-4小時。
3、轉(zhuǎn)膜，建議恒壓，15V，不用轉(zhuǎn)2小時，45分鐘足以。您所說的大蛋白轉(zhuǎn)過去的，并不是真正的少，而是因為在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾經(jīng)也轉(zhuǎn)過2小時，但和45分鐘的區(qū)別并不大。
4、根據(jù)MARKER的條帶（我的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據(jù)MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣第一，可以節(jié)省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。
5、延長1抗、2抗孵育時間（我曾室溫1小時，4度過夜），適當(dāng)加大1抗?jié)舛取?br> 6、我買的也是Santa Cruz的抗體，我覺得質(zhì)量還可以，我想您應(yīng)該先找其他方面的原因。

EEE. 電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉(zhuǎn)膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細胞和一抗在我的整個反應(yīng)體系下做出來了，當(dāng)然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題應(yīng)該出在抗原和一抗上，不知對不對。
解答：電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即可。正常條件下，電泳時溴酚藍和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以決定電泳的電壓和時間。建議你用恒壓80－100伏。

FFF. BIO-RAD的半干轉(zhuǎn)運系統(tǒng)有一個很致命的弱點就是無法控溫（我用的就是這種），當(dāng)電流過高，而系統(tǒng)的散熱又比較差，濾紙的吸水性比較差的情況下，就很容易燒膠。
就轉(zhuǎn)膜時，是采取恒壓還是恒流的問題，我想和大家探討一下，我感覺我這個系統(tǒng)用恒流很容易燒膠，我的膠有68cm2，用50mA恒流來轉(zhuǎn)膜，剛開始電壓就很高，有20 v左右，而用恒壓，開始電流有110mA，但15min后，電流就降到8OmA，30min后就穩(wěn)定在40mA，不就相當(dāng)于恒流嗎？
解答：恒流時電壓逐漸升高的原因是濕濾紙逐漸變干因而電阻逐漸增大的緣故，如果電壓升得太快，可以使濾紙更濕一些以克服。就我的感覺，20V的電流30min以后20Kd以下的分子丟失很多，不過我用的是小膠40cm2，不知有無不同。

GGG. 我想盡量提高轉(zhuǎn)膜的效率（我的實驗要求轉(zhuǎn)到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？
解答：不管怎么轉(zhuǎn)都會存在蛋白轉(zhuǎn)移不完全（電壓過小時間過短）或過度轉(zhuǎn)移（電壓過大時間過長）的問題，魚（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進行轉(zhuǎn)膜，下半時間短，上半時間長一點，應(yīng)該會好一些。

HHH. 請問一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？
解答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。

III. 1、煮好后的樣品，若沒有及時上樣分離，應(yīng)如何保存，可以保存多久？2、有沒有人在用bio-rad的小型垂直電泳槽，有沒有操作手冊？3、濕式轉(zhuǎn)移時是否必須要用bio-rad的專用濾紙？4、恒壓轉(zhuǎn)移的條件如何確定，因為我要分離小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移條件能夠相同嗎？5、凝膠的濃度是不是可以用一個濃度？書上寫不同的凝膠濃度分離的分子量范圍不同，還給出了一個線形范圍，是不是不在這個范圍內(nèi)也能分離，只是就不是線性范圍了？
解答：1、煮好后的樣品，放到-20，我們在一個月后此樣品，效果一樣。
2、bio-rad的小型垂直電泳槽的操作手冊在他們的主頁Bio-Rad USA上有。
3、轉(zhuǎn)移時一般的WATERMEN濾紙就可以。
4、轉(zhuǎn)移條件是和蛋白質(zhì)大小有關(guān)的：以次確定電壓和時間。具體可讓ptglab幫你定奪。
5、凝膠的濃度也是和分離蛋白質(zhì)大小有關(guān)。不是隨心所欲選的，否則分離效果可能不是你所期望的。