第六章　植物的器官培養(yǎng)

目的要求：

1．一般掌握離體根培養(yǎng)的取材部位和培養(yǎng)基的選擇

2．掌握莖尖培養(yǎng)的種類和操作步驟

3．掌握莖段培養(yǎng)中材料的選擇、處理及培養(yǎng)基的調(diào)整

4．掌握離體葉片的培養(yǎng)步驟

5．一般掌握胚胎培養(yǎng)的類型與各自的注意事項(xiàng)

器官培養(yǎng)包括離體的根、莖、葉、花器和果實(shí)的培養(yǎng)。以器官作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，是植物組織培養(yǎng)中最主要的一個(gè)方面，進(jìn)行的植物種類最多，應(yīng)用的范圍也最廣。器官培養(yǎng)不僅是研究器官生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)代謝、生理生化、組織分化和形態(tài)建成的最好材料和方法，而且在生產(chǎn)實(shí)踐上具有重要的應(yīng)用價(jià)值，如利用莖、葉和花器培養(yǎng)建立的試管苗，可在短期內(nèi)提高繁殖速率，進(jìn)行名貴品種的快速繁殖；利用莖尖培養(yǎng)可得到脫毒試管苗，解決品種的退化問題，提高產(chǎn)量和質(zhì)量；將植物器官作誘變處理，用器官培養(yǎng)可得到突變株，進(jìn)行細(xì)胞突變育種。

第一節(jié)　營(yíng)養(yǎng)器官培養(yǎng)

一、 離體根培養(yǎng)

離體根培養(yǎng)是進(jìn)行根系生理和代謝研究的最優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)體系，因?yàn)楦瞪L(zhǎng)快，代謝強(qiáng)，變異小，加上無(wú)菌，不受微生物干擾，能根據(jù)研究需要，改變培養(yǎng)的成分來(lái)研究其營(yíng)養(yǎng)吸收、生長(zhǎng)和代謝的變化。另一方面，由根細(xì)胞可再生成植株，不僅證明根細(xì)胞的全能性，也產(chǎn)生了無(wú)性繁殖系，用于生產(chǎn)實(shí)踐。培養(yǎng)方法如下：

1．培養(yǎng)基　多為無(wú)機(jī)離子濃度低的White培養(yǎng)基，其它培養(yǎng)基如MS、B5等也可采用，但必須將其濃度稀釋到2/3或1/2。

2．根無(wú)性繁殖系的建立　將種子進(jìn)行表面消毒，在無(wú)菌條件下萌發(fā)，待根伸長(zhǎng)后從根尖一端切取長(zhǎng)1.2cm的根尖，接種于培養(yǎng)基中。這些根的培養(yǎng)物生長(zhǎng)甚快，幾天后發(fā)育出側(cè)根。待側(cè)根生長(zhǎng)約一周后，即切取側(cè)根的根尖進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，它們又迅速生長(zhǎng)并長(zhǎng)出側(cè)根，又可切下進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)，就可得到從單個(gè)根尖衍生而來(lái)的離體根的無(wú)性系。這種根可用來(lái)進(jìn)行根系生理生化和代謝方面的實(shí)驗(yàn)研究。培養(yǎng)條件為暗光25～27℃。

3．植株再生培養(yǎng)? 根段的離體培養(yǎng)也可以用來(lái)再生植株。第一步誘導(dǎo)形成愈傷組織。第二步在再分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的分化、在愈傷組織上分化成小植株。

二、 莖尖培養(yǎng)

莖尖培養(yǎng)是切取莖的先端部分或莖尖分生組織部分，進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)。這是組織培養(yǎng)中用得最多的一個(gè)取材部位。莖尖培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)目的和取材大小可分為微莖尖培養(yǎng)和普通莖尖培養(yǎng)。微莖尖指帶有1～2個(gè)葉原基的生長(zhǎng)錐，其長(zhǎng)度不超過0.5mm。普通莖尖指較大的莖尖（如幾mm到幾十mm）、芽尖及側(cè)芽。這里主要講普通莖尖培養(yǎng)。這種培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單，操作方便，莖尖容易成活，成苗所需時(shí)間短。莖尖培養(yǎng)步驟如下：

1．取材　挑選雜菌污染少，生長(zhǎng)不久的莖尖。木本植物可在取材前對(duì)莖尖噴幾次滅菌藥劑。以保證材料不帶或少帶菌。用于普通莖尖培養(yǎng)，可先從植物的莖、藤或匍匐枝上切取2cm以上的頂梢。

2．消毒接種　將采到的莖尖切成0.5～1.0cm長(zhǎng)，并將大葉除去，休眠芽預(yù)先剝除鱗片。將莖尖置于流水沖洗2～4小時(shí)，再在95%的酒精中處理30秒，然后在稀釋20倍的次氯酸鈉中浸5～８分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，準(zhǔn)備接種。

3．接種　為了減少污染，可在接種前再剝掉一些葉片，使莖尖為0.5cm左右大小。這樣取莖尖大小只能作為快速繁殖。有些植物的莖尖由于多酚氧化酶的氧化作用而變褐。所以在接種時(shí)，不能用生銹的解剖刀，動(dòng)作要敏捷，隨切隨接，減少傷口在空氣中暴露的時(shí)間，也可配制1～5%V_C液，將切下的莖尖材料浸入處理一下。

4．培養(yǎng)的方法和程序

（1）培養(yǎng)基：多數(shù)莖尖培養(yǎng)采用MS作為基本培養(yǎng)基或略加修改，或補(bǔ)加其它物質(zhì)。常用的其它培養(yǎng)基有White,Heller等。

培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素是必須的，如2,4-D，IAA,NAA等，它們能有效地促進(jìn)芽的生長(zhǎng)發(fā)育，但是濃度不能太高，一般用0.1mg/L左右，高于此濃度，往往產(chǎn)生畸變芽或形成愈傷組織。但要注意不同植物對(duì)生長(zhǎng)素的反應(yīng)是不同的。

莖尖在培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)太慢、生長(zhǎng)太快和生長(zhǎng)正常等三種類型。生長(zhǎng)太慢即接種后莖尖不增大，只是莖尖逐漸變綠，出現(xiàn)綠色小點(diǎn)，細(xì)胞逐漸老化而進(jìn)入休眠狀態(tài)，或者逐漸變褐死亡。引起原因的是生長(zhǎng)素濃度太低，或是溫度過低或過高；生長(zhǎng)太快型是接種后莖尖迅速增大，在莖尖基部產(chǎn)生愈傷組織，并迅速增殖，而莖尖不伸長(zhǎng)，久之莖尖也形成愈傷組織，從而喪失發(fā)育成苗的能力。引起原因一是生長(zhǎng)素濃度過高，引起細(xì)胞瘋狂分裂而導(dǎo)致愈傷組織的形成。二是光照太弱或溫度太高。生長(zhǎng)正常型是接種后莖尖基部稍增大并形成少量愈傷組織，莖尖顏色逐漸變綠，并逐漸伸長(zhǎng)，葉原基發(fā)育成可見的小葉，進(jìn)而形成小苗。

（2）培養(yǎng)條件　接種到培養(yǎng)基上的莖尖，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天照光16小時(shí)，照度1500～3000Lx即可，溫度通常在25±2℃。并且應(yīng)根據(jù)不同植物種類，或者隨培養(yǎng)過程的不同，給予適當(dāng)?shù)臅円箿夭畹忍幚?。由于生長(zhǎng)點(diǎn)培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，瓊脂培養(yǎng)基易于干燥，這可以通過定期轉(zhuǎn)移和包口封嚴(yán)等加以解決。一般莖尖培養(yǎng)在40天左右可長(zhǎng)成新梢，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

（3）繼代培養(yǎng)　莖尖長(zhǎng)成的新梢，可切成若干小段，轉(zhuǎn)入到增殖培養(yǎng)基中。一個(gè)月左右，新梢又可切成小段，再轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基，這樣一代一代繼續(xù)下去，便建立和維持了莖尖無(wú)性系。繼代培養(yǎng)可用MS₀培養(yǎng)基。有時(shí)也可邊進(jìn)行繼代培養(yǎng)邊進(jìn)行誘導(dǎo)生根。取比較長(zhǎng)的新梢（如1cm以上）轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，余下較短的新梢進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

（4）誘導(dǎo)生根　誘導(dǎo)生根多采用1/2 MS培養(yǎng)基，即MS培養(yǎng)基的各種組成成份用量均減半的培養(yǎng)基。并加入一定的生長(zhǎng)素類調(diào)節(jié)物質(zhì)，如NAA 、IBA等。也可將切下的新梢基部浸入50或100ppm的IBA溶液處理4～8小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的生根培養(yǎng)基中。注意較高濃度的生長(zhǎng)素對(duì)生根有抑制作用。如果新梢周齡較大、木質(zhì)化程度較高，則用IBA處理的時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)或其濃度提高。

5．移栽入土? 在生根培養(yǎng)一個(gè)月左右，多數(shù)新梢即可獲得生長(zhǎng)健壯而發(fā)達(dá)的根系。移植時(shí)可根據(jù)生根情況來(lái)進(jìn)行。若發(fā)現(xiàn)新梢基部生有較濃密的不定根，長(zhǎng)度在1cm以內(nèi)，就可移栽入土。移栽時(shí)通過幾天的煉苗過程，從試管中取出小植株，輕輕洗掉培養(yǎng)基，栽入塑料營(yíng)養(yǎng)缽或育苗盤中，營(yíng)養(yǎng)缽盛經(jīng)燒烤或常壓滅菌的培養(yǎng)土（1分腐殖土：1分沙）中。

栽后給予較高的空氣濕度條件。首先營(yíng)養(yǎng)缽的培養(yǎng)土要澆透水，所放置的床面也要澆濕，然后搭小拱棚，以減少水分的蒸騰，并且初期要常噴霧處理，保持拱棚薄膜上有水珠出現(xiàn)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)小苗有生長(zhǎng)趨勢(shì)，可逐漸減少濕度將拱棚兩端打開通風(fēng)，并且減少噴水次數(shù)。使小苗適應(yīng)濕度較小的條件。以后揭去拱棚的薄膜，并給予水分控制，少澆水或不澆水，促進(jìn)小苗長(zhǎng)得粗壯。

溫度管理上要掌握適宜的生根溫度，最適宜的溫度是16～20℃，春季地溫較低時(shí)，可用電熱線來(lái)加溫。

光照管理上初期可用較弱的光照，在小拱棚上加蓋遮陽(yáng)網(wǎng)或報(bào)紙等，以防陽(yáng)光灼傷小苗和增加蒸騰作用，后期可直接利用自然光照。

為了提高馴化效率，可用育苗盤進(jìn)行馴化生根、孔徑選擇2cm左右即可。孔穴裝入蛭石：珍珠巖：草炭土為1:1:0.5的基質(zhì)。當(dāng)小苗長(zhǎng)至5cm高左右再移入塑料營(yíng)養(yǎng)缽中。

三、莖段培養(yǎng)

莖段培養(yǎng)指不帶芽和帶1個(gè)以上定芽或不定芽的，包括塊莖、球莖在內(nèi)的幼莖切段的無(wú)菌培養(yǎng)。培養(yǎng)莖段的主要目的是快繁。其次也可探討莖細(xì)胞的生理，以及進(jìn)行育種上的篩選突變體的過程。

莖段培養(yǎng)用于快速繁殖的優(yōu)點(diǎn)在于：培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單易行，繁殖速度較快；芽生芽方式增殖的苗木質(zhì)量好，且無(wú)病，性狀均一；解決不能用種子繁殖的無(wú)性繁殖植物的快速繁殖問題等。

1．材料的選擇和處理　取生長(zhǎng)健壯無(wú)病蟲的幼嫩枝條或鱗莖盤，若是木本，取當(dāng)年生嫩枝或一年生枝條,剪去葉片，剪成3～4cm的小段。在自來(lái)水中沖洗1～3小時(shí)，于無(wú)菌條件下用75%酒精滅菌30～60秒，再用0.1%升汞浸泡3～8分鐘，或用飽和漂白粉浸泡10～20分鐘，因材料老嫩和蠟質(zhì)多少而定時(shí)間。最后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，以備接種。取材時(shí)注意莖的基部比頂部切段，側(cè)芽比頂芽的成活率低，所以應(yīng)優(yōu)先利用頂部的外植體，但由于每個(gè)新梢僅一個(gè)頂芽，也可利用腋芽，莖上部的腋芽培養(yǎng)效果較好。還應(yīng)注意盡量在生長(zhǎng)期取芽，在休眠期取外植體，成活率降低。如蘋果在3～6月取材的成活率為60%，7～11月下降到10%，12～2月都在10%以下。

2．培養(yǎng)　最常用的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，加入3%蔗糖，用0.7%的瓊脂固化。培養(yǎng)條件保持25℃左右，給予充分的光照和光期。經(jīng)培養(yǎng)后莖段的切口特別是基部切口上會(huì)長(zhǎng)出愈傷組織，呈現(xiàn)稍許增大，而芽開始長(zhǎng)長(zhǎng)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)叢生芽，從而得到無(wú)菌苗。

在莖段培養(yǎng)中，促進(jìn)腋芽增殖用6-BA是最為有效的，依次為Kt和Zt等。生長(zhǎng)素雖不能促進(jìn)腋芽增殖，但可改善苗的生長(zhǎng)。GA對(duì)芽伸長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

繼代擴(kuò)繁是莖段培養(yǎng)的主要一步。這可由二種途徑解決:一是促進(jìn)腋芽的快速生長(zhǎng)，二是誘導(dǎo)形成大量不定芽。第一種途徑的好處是不會(huì)產(chǎn)生變異，能保持品種優(yōu)良特性。且方法簡(jiǎn)便，可在各種植物上使用，每年從一個(gè)芽可增殖10萬(wàn)株以上。第二種途徑會(huì)產(chǎn)生變異。

繼代增殖過程所用培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與初代培養(yǎng)相同。

生根培養(yǎng)的目的是使再生的大量試管苗形成根系，獲得完整的植株。創(chuàng)造適于根的發(fā)生和生長(zhǎng)的條件，主要是降低或除去細(xì)胞分裂素而加入生長(zhǎng)素。由于在苗增殖時(shí)施用了較高濃度的細(xì)胞分裂素，其苗中保持著一定的量，因此在生根培養(yǎng)中不需要加細(xì)胞分裂素。生長(zhǎng)素的濃度，NAA一般0.1～1.0mg/L，IBA和IAA可稍高。

試管苗的生根，對(duì)基本培養(yǎng)基的種類要求不嚴(yán)，如MS、B₅、White等培養(yǎng)基，都可用于誘導(dǎo)生根，但是其含鹽濃度要適當(dāng)加以稀釋。前面的幾種培養(yǎng)基中，除White外，都富含N、P、K鹽，它們都抑制根的發(fā)生。因此，應(yīng)將它們降低到1/2、1/3或1/4，甚至更低的水平。

生根培養(yǎng)時(shí)增強(qiáng)光照有利于發(fā)根，且對(duì)成功地移栽到盆缽中有良好作用。故在生根培養(yǎng)時(shí)應(yīng)增加光照時(shí)間和光照強(qiáng)度，但強(qiáng)光直接照射根部，含抑制根的生長(zhǎng)，所以在生根培養(yǎng)時(shí)最好在培養(yǎng)基中加0.3%活性炭，以促進(jìn)生根。

3．移植　這是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵一環(huán)。試管苗是在恒溫、保濕、營(yíng)養(yǎng)豐富、激素適當(dāng)和無(wú)菌條件下生長(zhǎng)的。植物的組織發(fā)育程度不佳，植株幼嫩，表皮角質(zhì)層變薄，抵抗力減小減弱。移植是一個(gè)由異養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)的過程。因此，在馴化時(shí)要進(jìn)行煉苗。然后洗凈瓊脂，小心移栽，初期濕度要大，基質(zhì)通氣濕潤(rùn)，保濕保溫，更要精心管理等。

四、離體葉培養(yǎng)

離體葉培養(yǎng)包括葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉在內(nèi)的葉組織的無(wú)菌培養(yǎng)。它大多經(jīng)脫分化形成愈傷組織，再由后者分化出莖和根。

葉是植物進(jìn)行光合作用的自養(yǎng)器官，又是某些植物的繁殖器官，因此葉培養(yǎng)不僅可用于研究形態(tài)建成、光合作用、葉綠素形成等理論問題，而且也是繁殖稀有名貴品種的有效手段。

在自然界，很多植物的葉具有強(qiáng)大的再生能力，能從葉片產(chǎn)生不定芽的植物，以羊齒植物最多，雙子葉植物次之，單子葉植物最少。再生成植株的方式有二種：一種是直接誘導(dǎo)形成芽，另一種是先誘導(dǎo)形成愈傷組織，再經(jīng)愈傷組織分化成植株，葉的離體培養(yǎng)技術(shù)如下：

１．材料選擇及滅菌? 取植物的幼嫩葉片沖洗干凈，用70%酒精漂洗約10秒，再在飽和漂白粉液中浸3～15分鐘，或在0.1%升汞中浸3～5分鐘，用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再放在無(wú)菌的干濾紙上吸干水分，以供接種用。對(duì)一些粗糙或帶茸毛的葉片要延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。注意要選擇成熟的葉片。一般地說(shuō)，同一葉片的柵欄組織比海綿組織處于較成熟狀態(tài)。在培養(yǎng)葉肉時(shí)因?yàn)楹＞d組織在分裂前就死亡，如果柵欄組織不發(fā)達(dá)的話就難于培養(yǎng)。

2．接種　把滅菌過的葉組織切成約0.5cm見方小塊或薄片（如葉柄和子葉），接種在MS或其它培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基中附加BA1～3mg/L，NAA0.25～1mg/L。

３．培養(yǎng)? 葉接種后培養(yǎng)條件為每天10～12小時(shí)光照，光強(qiáng)1500～3000Lx。培養(yǎng)約2周至4周，葉切塊開始增厚腫大，進(jìn)而形成愈傷組織。這時(shí)應(yīng)轉(zhuǎn)移到再分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，分化培養(yǎng)基的細(xì)胞分裂素含量為2mg/L左右，約10天左右，愈傷組織開始轉(zhuǎn)綠出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，它將發(fā)育成無(wú)根苗。若再將苗移至含NAA0.5～1mg/L的生根培養(yǎng)基可誘導(dǎo)成根，從而發(fā)育形成完整植株。

葉的培養(yǎng)比胚，莖尖和莖段培養(yǎng)難度大。首先要選用易培養(yǎng)成功的葉組織，如幼葉比成熟葉易培養(yǎng)，子葉比葉片易培養(yǎng)。其次要添加適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，保證利于葉組織的脫分化和再分化。

第二節(jié)　生殖器官培養(yǎng)

一、 花器官和種子培養(yǎng)

（一）花器官培養(yǎng)

花器官培養(yǎng)指整個(gè)花器及其組成部分如花托、花瓣、花絲、花柄、子房、花藥等的無(wú)菌培養(yǎng)。子房和花藥培養(yǎng)另有專門敘述，不再重復(fù)。

花器培養(yǎng)無(wú)論在理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用上都有重要價(jià)值。通過離體花芽培養(yǎng)可了解整體植物和內(nèi)源激素在花芽性別決定中所起的作用。可以了解花器各部分對(duì)果實(shí)和種子發(fā)育的作用，以及內(nèi)、外源激素在果實(shí)種子發(fā)育過程中的調(diào)控作用。生產(chǎn)上可用于珍貴品種的擴(kuò)大繁殖。培養(yǎng)方法如下：

1．取材　從健壯植株上取未開放的花蕾，已經(jīng)開花的不宜用，因?yàn)橄纠щy。先用75%酒精消毒約30秒鐘，再用飽和漂白粉浸10～15分鐘，取出用無(wú)菌水沖洗數(shù)次。

2．接種培養(yǎng)　用整個(gè)花蕾培養(yǎng)時(shí)，只要把花梗插入培養(yǎng)基中。若用花器的某個(gè)部分，則分別取下，切成小片，放入培養(yǎng)基中。常用的培養(yǎng)基有MS、B₅等。若要把花器官部分培育成小植株，要加入生長(zhǎng)激素和細(xì)胞分裂素，誘導(dǎo)形成愈傷組織或胚狀體，再分化培養(yǎng)成植株。如菊花的花瓣片接在含6-BA 2mg/L、NAA 0.2的MS培養(yǎng)基上，在26℃1500Lx光照，每天光照10小時(shí)，培養(yǎng)約2周，形成少量愈傷組織。再經(jīng)1個(gè)月就分化出綠色芽點(diǎn)，再切割轉(zhuǎn)接，可形成大量無(wú)根苗，經(jīng)長(zhǎng)根成植株，用于繁殖。

（二）種子培養(yǎng)

種子培養(yǎng)是指受精后發(fā)育完全的成熟種子和發(fā)育不完全的未成熟種子的無(wú)菌培養(yǎng)。早在1754年，Bonnet使不具子葉的蠶豆種子在無(wú)菌條件下培養(yǎng)萌發(fā)。到1904年，Hanning在無(wú)菌條件下培養(yǎng)胡蘿卜不同發(fā)育時(shí)期的種胚，獲得種子苗。隨后這項(xiàng)技術(shù)廣泛地應(yīng)用于花卉、蔬菜、果樹、農(nóng)作物等的種子培養(yǎng)之中。利用種子培養(yǎng)可以打破種子休眠，特別對(duì)一些休眠期長(zhǎng)的植物；可以作為大量生產(chǎn)試管苗的好材料，它具有植株分化容易，無(wú)菌操作方便等特點(diǎn)?？墒惯h(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生的雜種敗育種子，正常萌發(fā)產(chǎn)生第二代植株。培養(yǎng)技術(shù)如下：

1．種子滅菌? 種皮厚或不飽滿的種子，宜用0.1%升汞消毒10～20分鐘。幼嫩的或發(fā)育不全的種子，宜用飽和漂白粉消毒15～30分鐘。若種子上有絨毛或蠟質(zhì)，應(yīng)先用95%酒精或吐溫40處理，提高消毒效果。對(duì)殼厚難萌發(fā)的種子，可去殼培養(yǎng)。

2．培養(yǎng)基? 若以促進(jìn)種子萌發(fā)為目的種子培養(yǎng)，培養(yǎng)基的成分要求較簡(jiǎn)單，可不加或少加生長(zhǎng)激素。當(dāng)然，對(duì)某些發(fā)育不全的無(wú)胚乳的種子培養(yǎng)，應(yīng)提供適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)激素。種子培養(yǎng)的糖濃度可稍低，一般1～3%。

3．接種培養(yǎng)? 種子培養(yǎng)的接種較容易，把種子按每瓶3～5粒放入培養(yǎng)瓶中，均勻排列，放在20～28℃的條件下培養(yǎng)，1000～2000Lx光強(qiáng)，每天光照10小時(shí)。

二、 胚胎培養(yǎng)

植物胚胎培養(yǎng)是胚及胚器官（如子房、胚珠）在離體無(wú)菌條件下，使胚發(fā)育成幼苗的技術(shù)。包括幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)等。

胚胎培養(yǎng)已有近百年的歷史，1904年的Haning最早成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣椒的胚，并萌發(fā)形成小苗。30年代成功地把蘭科植物的胚培養(yǎng)成小植株。40年代在蘋果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、馬鈴薯、甘藍(lán)與大白菜的種間雜種的胚胎培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)及子房與胚珠培養(yǎng)均取得了不同程度的進(jìn)展。

（一）胚胎培養(yǎng)的意義

１．克服遠(yuǎn)緣雜種的不育性? 在高等植物的種間和屬間胚敗育，胚發(fā)育不全而不能正常萌發(fā)，因而得不到雜種種子，用胚胎培養(yǎng)和試管受精技術(shù)就可以解決這些問題。

２．使胚發(fā)育不全的植物獲得后代　如蘭花、天麻的種子成熟時(shí)，胚只有6～7個(gè)細(xì)胞，多數(shù)胚不能成活。如在種子接近成熟時(shí)，把胚分離出來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，就能生長(zhǎng)發(fā)育成正常植物。

３．縮短育種年限　在雜交育種中，應(yīng)用胚培養(yǎng)技術(shù)可以縮短育種周期1～2年。

（二）離體胚培養(yǎng)

植物在受精后，受精卵形成合子，隨即進(jìn)行第一次分裂，進(jìn)而形成分生組織和幼胚，再發(fā)育成成熟胚。在這個(gè)過程，胚靠消耗胚乳的營(yíng)養(yǎng)而發(fā)育，同時(shí)胚處在胚囊環(huán)境中，可吸收氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)。離體胚培養(yǎng)包括胚胎發(fā)生過程中不同發(fā)育期的胚，一般可分為成熟胚和幼胚培養(yǎng)。

１．成熟胚培養(yǎng)? 成熟胚一般指子葉期后至發(fā)育完全的胚。它培養(yǎng)較易成功，在含有無(wú)機(jī)大量元素和糖的培養(yǎng)基上，就能正常生長(zhǎng)成幼苗。由于種子外部有較厚的種皮包裹，不易造成損傷，易于進(jìn)行消毒，因此，將成熟或未成熟種子用70%酒精進(jìn)行幾秒鐘的表面消毒，再用無(wú)菌水沖洗3～4次，然后在無(wú)菌條件下進(jìn)行解剖，取出胚并接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)上培養(yǎng)。

２．幼胚培養(yǎng)? 幼胚是指子葉期以前的幼小胚，由于幼胚培養(yǎng)在遠(yuǎn)緣雜交育種上有極大的利用價(jià)值，因此，其研究和應(yīng)用越來(lái)越深入和廣泛。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善，幼胚培養(yǎng)技術(shù)也在進(jìn)步，現(xiàn)在可使心形期胚或更早期的長(zhǎng)度僅0.1～0.2mm的胚生長(zhǎng)發(fā)育成植株。由于胚越小就越難培養(yǎng)，所以，盡可能采用較大的胚進(jìn)行胚養(yǎng)。現(xiàn)在幼胚培養(yǎng)成功的有大麥、薺菜、甘蔗、甜菜、胡蘿卜等。

幼胚培養(yǎng)的操作方法同成熟胚培養(yǎng)基本相同，注意的是切取幼胚必須在高倍解剖鏡下進(jìn)行，操作時(shí)要特別細(xì)心，盡量取出完整的胚。在未成熟胚胎的培養(yǎng)中，常見有三種明顯不同的生長(zhǎng)方式，一種是繼續(xù)進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育，維持“胚性生長(zhǎng)”；另一種是在培養(yǎng)后迅速萌發(fā)成幼苗，而不繼續(xù)進(jìn)行胚性生長(zhǎng)，通常稱為“早熟萌發(fā)”；第三種是在很多情況下，胚在培養(yǎng)基中能發(fā)生細(xì)胞增殖形成愈傷組織，并由此再分化形成多個(gè)胚狀體或芽原基。特別是加有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，就更為如此。

幼胚培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，是提供幼胚所必需的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件。影響條件如下：

1.培養(yǎng)基? 成熟胚對(duì)培養(yǎng)基要求不高，而幼胚要求較高，常用的培養(yǎng)基有Tukey、MS、B₅、Nitsch培養(yǎng)基，其中前者適于成熟胚培養(yǎng)，其它適于未成熟胚和幼胚培養(yǎng)。

幼胚需要較高的蔗糖濃度，提供較高的滲透壓。由于幼胚在自然條件下賴以生存的是無(wú)定形的液體胚乳，具有較高的滲透壓，人工培養(yǎng)基中要?jiǎng)?chuàng)造高滲透壓的條件，它可以調(diào)節(jié)胚的生長(zhǎng)，阻止可能的滲透壓影響，還能抑制中早熟萌發(fā)中的細(xì)胞延長(zhǎng)，以及抑制胚的萌發(fā)，避免把細(xì)胞的伸長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)化為分裂狀態(tài)。

2.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)? 不同植物的胚培養(yǎng)需要的生長(zhǎng)物質(zhì)不同，如IAA可明顯促進(jìn)向日葵胚的生長(zhǎng)。IAA,Kt的共同作用可促進(jìn)薺菜幼胚的生長(zhǎng)。一般認(rèn)為IAA可使胚的長(zhǎng)度增加；加入BA可提高胚的生存機(jī)會(huì)。

將薺菜胚培養(yǎng)在一種簡(jiǎn)單的滲透壓未調(diào)整的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)或增加蔗糖或主要鹽類的濃度，能誘導(dǎo)更小的胚的生長(zhǎng)，這暗示滲透壓與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的復(fù)雜作用。顯然，高滲透壓的控制和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的化學(xué)調(diào)節(jié)，應(yīng)通過某種方式聯(lián)系起來(lái)?？赡茉谄?SPAN lang=EN-US>

衡的激素控制系統(tǒng)中，一種或幾種成分的活性，依次被高濃度的蔗糖或高濃度鹽所控制，也許通過滲透過程阻止細(xì)胞伸長(zhǎng)。

3.天然提取物的作用

椰乳對(duì)胚培養(yǎng)有一定的促進(jìn)作用，如番茄胚在含有50%椰乳的培養(yǎng)基中可維持生長(zhǎng)。另外對(duì)胡蘿卜幼小子葉階段的離體胚培養(yǎng)，也有促進(jìn)作用。

還有一些瓜類的胚乳提取物能促進(jìn)胚生長(zhǎng)的能力，可能是植物激素的細(xì)胞分裂物質(zhì)和一些有機(jī)氮化合物作用的結(jié)果。

4.溫光條件? 對(duì)于大多數(shù)植物的胚來(lái)說(shuō)，在25～30℃為宜，但是，早熟果樹如桃的種胚，必須經(jīng)過一定的低溫春化階段才能正常萌發(fā)生長(zhǎng)，而馬鈴薯胚以20℃為好。

光照可以促進(jìn)某些植物的胚轉(zhuǎn)綠，利于胚芽生長(zhǎng)，而黑暗利于胚根生長(zhǎng)。因此以光暗交替培養(yǎng)較為有利。

5.其它條件? 胚培養(yǎng)中除要求較高的蔗糖濃度、高滲透壓以外，還要求較高濃度的氨基酸及無(wú)機(jī)鹽。

三、胚珠培養(yǎng)

胚珠培養(yǎng)是將授粉的子房在無(wú)菌條件下解剖后，取胚珠置于培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程。有時(shí)也把胚珠連同胎座一起取下來(lái)培養(yǎng)。胚珠培養(yǎng)可以解決象蘭科植物成熟胚較小不易培養(yǎng)的問題。另一方面在未受精的胚珠培養(yǎng)中，可誘發(fā)大孢子發(fā)育成單倍體，用于單倍體育種。

培養(yǎng)時(shí)，從花中取出子房進(jìn)行表面消毒，在無(wú)菌條件下進(jìn)行解剖，取出胚珠，放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基多用Nistch培養(yǎng)基，不過諸如MS、N6、B5等培養(yǎng)基也可采用。

從胚珠培養(yǎng)成植株的關(guān)鍵是選擇胚的發(fā)育時(shí)期，實(shí)驗(yàn)證明發(fā)育到球形胚期的胚珠較易培養(yǎng)成功。另外為了培養(yǎng)成功，可取用帶胎座甚至帶部分子房的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)。

四、胚乳培養(yǎng)

胚乳是由兩個(gè)單倍的極核和一個(gè)單倍的精子結(jié)合而成的三倍體組織。由它可獲得無(wú)子結(jié)實(shí)的三倍體植株，進(jìn)而可將它加倍成六倍體植株。

取授粉4～8天后的幼果，常規(guī)消毒后，在無(wú)菌條件下切開果實(shí)，取出種子，小心分離出胚乳。接種在培養(yǎng)基上，可用MS、White等 ，加入2，4-D或NAA0.5～2.0mg/l，BA0.1～1.0 mg/l。

在25～27℃和黑暗條件或散射光下培養(yǎng),約6～10天胚乳開始膨大,再培養(yǎng)形成愈傷組織.這時(shí)應(yīng)轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng),分化培養(yǎng)基可加入0.5～3.0 mg/l的BA及少量的NAA。待愈傷組織長(zhǎng)出芽后,切下不定芽,插入生根培養(yǎng)基中，光下培養(yǎng)10～15天,切口處可長(zhǎng)出白色的不定根。

本章小結(jié)

1．植物器官培養(yǎng)是組織培養(yǎng)當(dāng)中一個(gè)最重要的方面，應(yīng)用范圍最廣泛。它是指植物離體的根、莖、葉、花、果和種子的無(wú)菌培養(yǎng)。

2．根培養(yǎng)不僅可以很方便地研究根的生理代謝，而且利用White培養(yǎng)基也能再生成幼小植株。

3．花培養(yǎng)是指整個(gè)花器官或花的組成部分之一的無(wú)菌培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基一般用MS或B5。

4．種子無(wú)菌培養(yǎng)操作簡(jiǎn)便，植株分化容易，可以一定程度上克服育種上遠(yuǎn)緣雜交的不育性。

5．胚胎培養(yǎng)包括幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)和胚乳培養(yǎng)等。具有以下意義：（1）克服遠(yuǎn)緣雜種的不育性，（2）使胚胎發(fā)育不完全的植株獲得后代，（3）縮短育種年限，提高育種效率。

復(fù)習(xí)思考題

1．為什么說(shuō)植物器官培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的一個(gè)最重要的方面？器官培養(yǎng)包括哪些類型？

2．植物的離體根培養(yǎng)有何意義？

3．普通莖尖培養(yǎng)時(shí)，怎樣取材和處理外植體？莖尖培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象？怎樣解決？

4．莖段培養(yǎng)與莖尖培養(yǎng)有什么主要區(qū)別？

5．花器官培養(yǎng)通常指花的哪些部分培養(yǎng)？常用的基本培養(yǎng)基是什么？

   6．植物胚胎培養(yǎng)分為哪些類型？各有何特點(diǎn)和要求？胚胎培養(yǎng)有何重要意義？