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1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了黑木耳菌種廠建造及黑木耳菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于黑龍江省黑木耳菌種廠建造及黑木耳菌種生產(chǎn)的單位與個(gè)人。
2 名詞解釋
2.1 母種：用各種分離方法，經(jīng)純化培養(yǎng)成的純黑木耳試管菌種（一級(jí)種）。
2.2 原種：用母種擴(kuò)接在木屑、谷粒等培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)成的菌絲體，稱原種（二級(jí)種）。
2.3 栽培種：用原種擴(kuò)大增殖的菌種，稱栽培種（三級(jí)種）。
2.4 無(wú)菌操作技術(shù)：又叫不帶菌作業(yè)。指操作的空間、使用的水質(zhì)、原料、工具以及人員操作過(guò)程中，不準(zhǔn)帶有任何雜菌。
2.5 培養(yǎng)基：培養(yǎng)黑木耳菌種生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
2.6 菌種分離：指食用菌母種（一級(jí)種）的分離、純化培養(yǎng)。從基物、子實(shí)體、菌絲體培養(yǎng)物中取得純菌種的過(guò)程。
2.7 孢子分離法：挑取孢子（種子），獲得純培養(yǎng)物的方法。
2.8 耳片分離法：從耳片中挑取菌絲體組織，獲得純培養(yǎng)物的方法。
2.9 耳木分離法：又叫寄主分離法，從黑木耳生存的基物（木段）中，獲得純培養(yǎng)物的方法。
3 黑木耳菌種廠建造
3.1 廠地選擇：設(shè)在遠(yuǎn)離污染源300m以上，空氣新鮮，交通方便之處。
3.2 廠內(nèi)條件：有水源、電源、供熱設(shè)備。
3.3 廠房結(jié)構(gòu)：磚木、磚混結(jié)構(gòu)，水泥地面，四壁、天棚白色、光潔。
3.4 廠房布局：按生產(chǎn)工藝流程，分設(shè)配料室、滅菌室、冷卻室、緩沖室、接種室、培養(yǎng)室、儲(chǔ)存室、試驗(yàn)室。各室既相連接又相隔
3.5 所需技術(shù)設(shè)備： 以上各室技術(shù)要求及所需儀器、設(shè)備、用具見(jiàn)表1。
表1 技術(shù)要求及儀器、設(shè)備表
4 母種
4.1 母種的分離
4.1.1 孢子分離法：選當(dāng)年生無(wú)雜菌污染耳片晾干，以黑、厚、大為佳；經(jīng)無(wú)菌水沖洗幾次，用絲線將耳片腹面向下，另一端掛吊在裝有培養(yǎng)基的三角瓶口部，加棉栓封口，在25℃～28℃溫箱中，接收孢子并培養(yǎng)成菌絲；經(jīng)鏡檢有鎖狀聯(lián)合后，再經(jīng)純化轉(zhuǎn)管培養(yǎng)即可。（培養(yǎng)基配方見(jiàn)4.2.1）
4.1.2 耳片分離法：選無(wú)雜菌污染，黑厚大鮮耳，經(jīng)無(wú)菌水沖洗幾次，在無(wú)菌條件下，切取耳肉中間層（髓層）菌肉，接入試管斜面培養(yǎng)基上，在25℃～28℃溫箱中培養(yǎng)長(zhǎng)出菌絲體，再經(jīng)純化轉(zhuǎn)管即成。
4.1.3 耳木分離法：選產(chǎn)耳多、生長(zhǎng)快、健壯、無(wú)雜菌的耳木晾干后，在無(wú)菌條件下，選取帶有菌絲的耳木片，移在平板培養(yǎng)基上，在25℃～28℃下培養(yǎng)，再經(jīng)提純，挑取健壯菌絲接在斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成熟后，再擴(kuò)大繁殖。
4.2 母種的制作
4.2.1 培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、KH2PO43g、MgSO41.5g、水1000mL。
4.2.2 制作方法：馬鈴薯削皮挖去芽眼，稱200g，洗凈切成碎快，入鍋內(nèi)加水1000mL，加熱煮20min（水開(kāi)后計(jì)時(shí)，切忌煮爛），取出用6層紗布過(guò)濾，取其汁液；再入鍋煮，補(bǔ)足水1000mL，同時(shí)加入其它配料，邊加熱邊攪拌，使之溶解均勻，趁熱分裝試管中。防止管口沾上汁液，用棉栓封實(shí)管口。每7支～10支用膠皮圈扎成一捆，并在管口部用牛皮紙包好，防止棉栓受潮或脫落。
4.2.3 滅菌：用手提式高壓鍋，加水至淹沒(méi)支架，將試管直立裝入內(nèi)層鍋里，蓋嚴(yán)鍋蓋加熱，當(dāng)氣壓上升到0.035Mpa時(shí)，開(kāi)排氣閥放冷空氣，待壓力指針下降到0℃，大量冷空氣排盡后，再關(guān)閉排氣閥門，繼續(xù)加溫，在115℃（0.069MPa）壓力下，滅菌30min即停止加熱，自然降溫，待指針下降到0℃后，打開(kāi)鍋蓋，取出試管，趁熱放在桌面橫木棍（棒）上，擺成占試管長(zhǎng)度1/3的斜面冷卻備用。
4.2.4 接種
4.2.4.1 消毒：使用前先用紫外線燈照射接種箱(室)30min，再用2%來(lái)蘇兒噴霧降塵后，即可接種（必要時(shí)可用10mL/m3甲醛，加6g高錳酸鉀自燃熏蒸消毒）。
4.2.4.2 接種準(zhǔn)備：接種人員進(jìn)入緩沖室，更換工作服、帽、穿拖鞋，洗手后，即可入接種室進(jìn)行接種。
4.2.4.3 接種方法：將母種和待接試管放進(jìn)接種箱內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，用75%酒精棉擦洗雙手和接種工具，在燈火上方接種。拔掉棉栓后，用火焰封試管口。先將工具放在燈火上方燒燎片刻，并插入試管口內(nèi)冷卻片刻，迅速挑取一小塊菌絲體，接入另一支試管培養(yǎng)基中間，用火焰燎一下棉栓并封實(shí)管口，再接下一支。
如用超凈工作臺(tái)接種，一般開(kāi)機(jī)后30min，使作業(yè)區(qū)空氣凈化，方可接種。
4.2.5 培養(yǎng)：將接好種的試管，放入恒溫箱中25℃±1℃培養(yǎng)。
4.2.6 儲(chǔ)存：將長(zhǎng)滿白色菌絲的試管，放入1℃～4℃冰箱中保存。
5 原種的制作
5.1 洗凈菌瓶：用小口頸白色透明瓶，先用堿水洗凈，再用清水沖洗控干備用。
5.2 培養(yǎng)基配方：闊葉木屑79%、新鮮麥麩或米糠20%、碳酸鈣或硫酸鈣1%。含水率60%左右。
5.3 配制方法：清除木屑中雜物、樹皮，再將各種配料混合拌均勻，加水，使料中含水率均達(dá)60%左右。
5.4 裝瓶：將培養(yǎng)料及時(shí)裝入白瓶中2/3量，下松上緊，中間直扎一孔，加棉栓封瓶口。
5.5 滅菌：將裝好料的菌瓶放入鐵筐中，搬進(jìn)高壓鍋內(nèi)滅菌，在123℃（0.118MPa）壓力下，連續(xù)60min～90min即好。如用常壓鍋，在100℃（上大氣時(shí)，用溫度計(jì)測(cè)溫記時(shí)），持續(xù)7h～8h以上即可。
5.6 冷卻：搬進(jìn)冷卻室內(nèi)冷卻降溫28℃以下備用。
5.7 接種：同4.2.4。所不同的是，將母種接入原種瓶培養(yǎng)基中間孔穴里及孔穴口面上，加棉栓塞緊。
5.8 培養(yǎng)：將原種瓶放在培養(yǎng)室架子上，在25℃～28℃下培養(yǎng)15d～30d。每周檢查1次，淘汰污染者。
5.9 保存：放入5℃～8℃儲(chǔ)存室內(nèi)，在衛(wèi)生、干燥、無(wú)光環(huán)境下保存。
6 栽培種的制作
6.1 培養(yǎng)基配方：同5.2。
6.2 配制方法：同5.3。
6.3 裝瓶（或塑料袋）
6.3.1 菌瓶：用廣口瓶，或用17cmX33cm聚乙烯或聚丙烯塑料袋，事先用清水洗凈備用。
6.3.2 裝料量：每瓶（袋）裝0.9kg±0.1kg濕料。
6.3.3 裝料方法：用裝瓶裝袋機(jī)或人工裝料，壓實(shí)壓平至瓶頸下，中間扎一孔穴到瓶底，加棉栓塞緊。如用塑料袋，裝滿袋后，壓實(shí)壓平到袋子2/3處，中扎一孔接近袋底，上粗下細(xì)，加棉栓或?qū)Ｓ蒙w子封嚴(yán)袋口。
6.4 滅菌：同5.5。
6.5 冷卻：同 5.6。
6.6 接種方法：同5.7。所不同的是，原種瓶橫放小木架上，燈火封瓶口，挖出原種2勺～3勺，接入瓶子或塑料袋扎眼里及眼上，加棉栓塞緊即可。
6.7 培養(yǎng)：同5.8。
6.8 保存：同5.9。
7 菌種質(zhì)量：
7.1 母種
7.1.1 目測(cè)：斜面正面外觀，菌絲潔白，細(xì)毛狀，毛短整齊均勻，無(wú)拮抗線，無(wú)雜菌污染。長(zhǎng)滿斜面時(shí)，背面常生米黃色或茶褐色色素，使培養(yǎng)基染成褐色或暗褐色 。但絕對(duì)不準(zhǔn)有綠、黃、紅、黑、灰等色 霉菌和粘狀細(xì)菌菌落。
7.1.2 鏡檢：在顯微鏡下觀察，菌絲體無(wú)色透明，有分枝和鎖狀聯(lián)合。
7.2 原種
7.2.1 目測(cè)：菌絲體純白，整齊、粗壯，培養(yǎng)料內(nèi)外發(fā)育均勻。有時(shí)上方出現(xiàn)菌膜呈微褐色，或瓶壁內(nèi)出現(xiàn)膠質(zhì)原基，為淡褐色至黑褐色。但不準(zhǔn)有綠、黃、紅、黑、灰、等色的霉菌和粘狀物。培養(yǎng)料緊貼瓶壁，平底無(wú)積液，瓶壁完整衛(wèi)生。菌種容量：瓶裝原種為230g±10g。
7.2.2 鏡檢：菌絲體分枝，交織密集，無(wú)色透明，粗細(xì)不勻，有鎖狀聯(lián)合。
7.2.3 做出耳試驗(yàn)：每批產(chǎn)品隨機(jī)取樣，做出耳試驗(yàn)。檢查菌種出耳質(zhì)量及產(chǎn)耳特性。
7.3 栽培種：目測(cè)、鏡檢、做出耳試驗(yàn)同原種。
8 菌種的包裝與標(biāo)志
8.1 母種：每支母種要塞緊棉栓，防止脫落，另用牛皮紙包好扎緊，再用紙張將整個(gè)試管扎緊。要逐支注明：菌號(hào)（名）、廠名、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)。外面標(biāo)明：防壓、防潮、防凍、防倒置等標(biāo)記。
8.2 原種及栽培種：每瓶（袋）菌種口部帶棉栓，并用紙張包緊，裝箱。箱外注明：菌號(hào)（名）、廠名、廠址、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、數(shù)量、凈含量、合格證等。還要標(biāo)明：防壓、防潮、防曝曬、防倒置標(biāo)記。
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