儀器、原料和試劑
儀器
聚苯乙烯96孔酶標(biāo)板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、洗板儀。
試劑及試劑配制
1. 抗原及酶標(biāo)記抗體
①抗原： IgG

②酶標(biāo)抗抗體：羊抗鼠IgG-HRP
2.包被液（CBS）：Na2CO3   0.8g，NaHCO3  1.46g，水溶解，定容500ml。

3. 封閉液（3％BSA+CBS 或5％牛奶+CBS）：含3％牛血清白蛋白（BSA）：10mL CBS中加入0.3g BSA。含5％荷蘭牛奶：10mL CBS中加入0.5g牛奶 。
4. 洗滌液（PBST 10*）：KH2PO4   4g，Na2HPO4·12H2O    58g，NaCl   160g， KCl  4g，Tween-20 10mL  加水定容2L。
 5. 洗滌液(1*PBS)： PBST：H2O=1：9

6. 底物溶液（4甲基酰苯氨）
①TMB底物緩沖液(0.005mol/LPH3.6醋酸鈉-檸檬酸緩沖液)：稱(chēng)NaAc·3H2O：1.13g，C6H8O7·H2O ：1.05g，用蒸餾水溶解，定容至1000mL，調(diào)PH=3.6。
② TMB底物液：稱(chēng)3,3＇,5,5＇-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）0.08g 溶于40mL 二甲基亞砜（DMSO）中，加60 mL 甲醇，混勻，加100mL 底物緩沖液，在暗處避光攪拌2小時(shí)至溶解，4℃避光保存。
③H2O2 底物液：取140μL過(guò)氧化氫（H2O2）加入200mL底物緩沖液混勻。
④底物應(yīng)用液：現(xiàn)用現(xiàn)配，TMB:H2O2=1:1混勻。

7. 終止液：2mol/L H2SO4
四、操作步驟
①抗原包被過(guò)夜（12h以上）： IgG抗原，用包被液（CBS）稀釋?zhuān)?span lang=EN-US>100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板中。4℃放置過(guò)夜。

抗原用量：0.1μg*100N/抗原濃度 （N為板數(shù)）
②封閉：棄上清 加300μL/孔封閉液，37℃放置2h。
③洗滌：用洗滌液洗3次
④加一抗(待測(cè)樣品為細(xì)胞培養(yǎng)上清)：將含單克降抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清100μL /孔加到已包被的板上，空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，已知樣品血清（1：200稀釋于1%BSA+PBST中）作為陽(yáng)性對(duì)照。37℃恒溫箱溫育2h。
測(cè)免疫效價(jià)待測(cè)樣品為小鼠血清時(shí)：采小鼠血液于常溫20min左右后放4℃至析出血清，3000r 10min離心。將含抗體的血清在已包被的板上用1%BSA+PBST連續(xù)倍比稀釋(按照1：200開(kāi)始)，100μL /孔。每個(gè)樣品平行做兩份，小鼠陰性血清或空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，已知樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。37℃恒溫箱溫育2h。
⑤洗滌：用洗滌液洗5次。
⑥加二抗（酶標(biāo)抗抗體）：羊抗鼠IgG-HRP，用1%BSA+PBST l ：10000稀釋?zhuān)?span lang=EN-US>100μL／孔， 37℃恒溫箱溫育1h。
⑦洗滌：用洗滌液洗5次，
⑧顯色：加新鮮配制的底物溶液(TMB:H2O2=1:1)100μL/孔，37℃恒溫箱放置10min，顯示藍(lán)色。
⑨終止反應(yīng)、比色：加30μL/孔H2SO4終止液．顏色變黃；用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm  630nm處各孔的吸光值，陽(yáng)性反應(yīng)的最大稀釋度為待測(cè)樣品的效價(jià)。