1、生物技術：指以現(xiàn)代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其它基礎學科的科學原理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類提供商品和服務的一個綜合技術體系。

2、基因工程：利用DNA體外重組或PCR擴增技術從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反應形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當?shù)氖荏w細胞，以期獲得基因表達的過程。

3、蛋白質(zhì)工程：在基因工程技術對編碼蛋白質(zhì)的基因了解的基礎上，對蛋白質(zhì)的氨基酸序列、結構和功能進行分析，進而通過對蛋白質(zhì)的結構、氨基酸序列和翻譯后的修飾等手段改變甚至創(chuàng)造出新的和更有效的蛋白質(zhì)。

4、限制性核酸內(nèi)切酶(restriction  endonuclease)：識別DNA的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。

5、轉(zhuǎn)導作用transduction：通過病毒介導發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。

6、基因文庫的構建：用限制性內(nèi)切酶對DNA酶解，然后把酶解的片段克隆進載體，再對重組克隆進行鑒定、分離、再培養(yǎng)和進一步鑒定，整個過程稱為基因文庫的構建。

7、分子雜交：不同來源的核酸經(jīng)變性和復性的過程，其中一些不同的核苷酸單鏈由于存在局部堿基互補片段，而在復性時形成雜化雙鏈（heteroduplex），此過程稱分子雜交。

8、基因表達：細胞在生命過程中，把蘊藏在DNA中的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成為具有功能的蛋白質(zhì)分子的過程稱為基因表達 (gene expression) 。

9、融合蛋白：外源蛋白在異源宿主細胞中含量通常很低，因此其會被宿主細胞降解。將要表達的外源蛋白與一個宿主的蛋白共價結合形成融合蛋白。

10、非融合蛋白：指所表達的外源蛋白的N端或C端不含任何其他氨基酸，因此要求翻譯起始氨基酸位點ATG必須位于要表達的外源基因片段的5’端，終止密碼子必須位于要表達的外源基因片段的3’端。

11、外源蛋白質(zhì)的復性：指變性的包含體蛋白在適當?shù)臈l件下折疊成有活性的蛋白質(zhì)的過程。包括表達蛋白中二硫鍵的正確形成和正確空間構象的形成。

12、寡核苷酸介導的誘變（定點誘變）：在DNA水平上改變氨基酸的編碼序列，若蛋白的三級結構已經(jīng)由X射線晶體衍射或其他方法測定，則較容易判定應改變哪個氨基酸以獲得預期的性狀。

13、現(xiàn)代發(fā)酵工程的主體是利用微生物，特別是經(jīng)DNA重組技術改造過的微生物來生產(chǎn)商業(yè)產(chǎn)品,或直接把微生物應用于工業(yè)生產(chǎn)過程中的一種新技術。

14、罐批發(fā)酵：在滅菌的培養(yǎng)基上接種相應的微生物，然后不再加入新的培養(yǎng)基。

15、補料分批發(fā)酵：發(fā)酵過程中在不同時期加入越來越多的營養(yǎng)物，但不除去舊的培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基的量逐漸增大，可以延長對數(shù)期與靜止期的持續(xù)時間，增加生物量的積累，也能增加靜止期的細胞代謝產(chǎn)物的積累。

16、連續(xù)發(fā)酵：在發(fā)酵過程中不斷加入新鮮的培養(yǎng)基，同時除去等體積的舊的含懸浮的微生物的培養(yǎng)基。

17、浮集法收集：利用高壓或電解可以產(chǎn)生大量的微小氣泡，當有長鏈脂肪酸或胺存在時，氣泡可以穩(wěn)定存在相當長的時間。在適當條件下，細胞就可以被這些氣泡所吸附而停留在泡沫層中。只收集泡沫層，改變條件去掉氣泡，就可以得到需要的微生物細胞。

18、生物農(nóng)藥：指由生物體產(chǎn)生的具有防治病、蟲害和除雜草等功能的一大類物質(zhì)的總稱。它們大多數(shù)是生物體的代謝產(chǎn)物，包括微生物殺蟲劑、農(nóng)用抗生素制劑和微生物除草劑等。

19、抗生素：指由生物（包括微生物、植物和動物）在其生命活動過程中所產(chǎn)生的活性物質(zhì)，這類物質(zhì)能以極小的濃度選擇性地抑制或殺滅其他微生物或腫瘤細胞、抑制酶的活性、殺蟲或刺激作物生長。

20、生物除草劑：是指使用雜草的天敵或雜草的致病物質(zhì)來防治雜草，使雜草的密度降低到經(jīng)濟上能夠容許的水平，但并非是根除雜草。

21、細菌素：指一種細菌的某些株系所產(chǎn)生的對該種細菌的另一些菌株或關系較近的其他細菌有殺傷作用、非復制性的含蛋白質(zhì)的抗菌物質(zhì)。

22、生物凈化：利用生物來除去環(huán)境中的生物垃圾和有毒物質(zhì)的過程。

23、微生物蛋白：又稱單細胞蛋白（SCP） ，是從純培養(yǎng)的微生物細胞中提取的總蛋白，可以作為人或動物蛋白的補充。

24、復合穿梭載體：即把不同生物來源、控制各種有用特性的遺傳元件集中在一起構建穿梭載體，使之可以在特定細胞的特定條件下工作。

25、血影細胞：指哺乳動物的紅細胞在機械作用、病毒誘導、低滲等條件下發(fā)生溶血，使血紅蛋白大量溢出，僅剩下細胞膜包被的細胞核結構。

26、基因槍法：通過高壓氣體等動力，高速發(fā)射包裹有重組DNA的金屬顆粒，將目的基因直接導入受體細胞，整合到染色體上，并從這些細胞再生出完整的植株。

27、轉(zhuǎn)基因動物：用實驗導入的方法使外源基因在染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合，并能遺傳給后代的一類動物。

28、基因敲除：利用基因定向插入某一內(nèi)源基因而破壞其功能的方法，來研究某一特定基因在發(fā)育過程中的功能。

29、抗體：淋巴細胞經(jīng)誘導產(chǎn)生的特異蛋白，在其他免疫蛋白的幫助下與外來物質(zhì)結合，抵消其生物學功能，保護自己不受有毒物質(zhì)和病原菌的侵害。

30、抗原決定簇：對于一個免疫刺激，每一個淋巴細胞都會合成并分泌一種單個的抗體，這些抗體可以高度特異地識別免疫抗原的特定區(qū)域，也就是抗原決定簇。

31、單克隆抗體：通過B細胞雜交瘤技術, 獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體。

32、抗體融合蛋白：抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性。

33、現(xiàn)代分子診斷技術：利用現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學的技術方法，直接探測基因結構及其表達水平，從而對疾病作出診斷的方法。

34、疫苗：利用微生物及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒或滅活或基因工程等方法制成，用于預防疾病的自動免疫制劑。

35、基因工程疫苗：利用現(xiàn)代基因工程技術將有效的特異性抗原基因插入易于增殖的載體，在載體增殖時可表達有效特異性抗原，取之作為疫苗。如基因工程乙肝疫苗。

36、亞基疫苗：單純的外殼結合蛋白即可以在受體內(nèi)激發(fā)成足夠多的抗體，因此可以利用病原物的某一部分制得的疫苗。

37、DNA免疫：又稱基因免疫，系指將靶抗原編碼基因置于真核表達調(diào)控元件的調(diào)控下，將該質(zhì)粒DNA直接進行動物體內(nèi)接種，并以與自然感染類似的方式呈遞抗原，誘生特異性體液和細胞免疫應答的新理論和技術。

38、基因芯片（DNA微陣列）：通過微陣列(Microarray)技術將高密度DNA片段陣列通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究。

1、以PBR322為例，說明如何篩選陽性重組子？

           BamHI片段(Tcr)

PBR322

           PstI(Apr)片段                          重組分子I

             PstI片段     重組分子Ⅱ(Aps Tcr)      (Apr Tcs）

外源DNA

             BamHI片段

重組分子Ⅰ    分別轉(zhuǎn)化E.coli      涂布Ap平板           Apr轉(zhuǎn)化子

重組分子Ⅱ      (ApS TcS)         涂布Tc平板          Tcr轉(zhuǎn)化子

        影印到Tc平板上        Apr TcS為重組子   Apr Tcr為原載體

        影印到Ap平板上        ApS Tcr為重組子   即為非重組子

2、作為理想載體，質(zhì)粒需具備那些條件？ 

（1）具有松弛型復制子；           

（2）在復制子外存在多克隆位點；

（3）具有插入失活的篩選標記；     

（4）分子量較小，拷貝數(shù)較高。

3、限制性內(nèi)切酶識別順序和酶切位點

（1）識別４-8個相連的核苷酸；   

（2）富含GC；

（3）對稱性------雙對稱；         

（4）切點大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外；

（5）限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結構是５’-P和３’-OＨ。

4、敘述用大腸桿菌質(zhì)粒pBR316篩選啟動子的過程。

使用tetr作報告基因分離功能啟動子

（1）首先在大腸桿菌質(zhì)粒pBR316（含有一個tet基因、Hind Ⅲ位點）上的tet的啟動子序列中插入一個EcoR1的酶切位點（ pBRH3B, pBRH1 ），使之失活。

（2）將純化的細菌染色體DNA片斷，克隆在pBRH3B或 pBRH1 的EcoR1限制性位點上；轉(zhuǎn)化給對tet敏感的大腸桿菌寄主細胞。

5、若克隆的基因有罕見密碼子，如何提高蛋白表達量。

（1）如果罕見密碼子在目的基因中出現(xiàn)頻率低：利用密碼子的簡并性，對外源基因進行定點突變，將罕見密碼子突變?yōu)樗拗鞒Ｓ玫拿艽a子，但不改變基因所編碼的氨基酸序列。

（2）若目的基因中的罕見密碼子含量較高：通過基因工程的方法，將編碼識別罕見密碼子的tRNA的基因轉(zhuǎn)入細菌細胞中，從而使轉(zhuǎn)化后的細菌能夠大量地轉(zhuǎn)錄可識別罕見密碼子的tRNA。

6、敘述雙質(zhì)粒系統(tǒng)作用原理。

（1）用trp啟動子帶動編碼cI阻遏蛋白的基因,并將它們置于一個低拷貝的質(zhì)粒上；

（2）將要表達的基因置于PL啟動子的下游,使其表達受PL啟動子的調(diào)控。

（3）把這兩個質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入宿主細胞，當培養(yǎng)基中沒有色氨酸時， trp啟動子啟動，合成cI蛋白，PL帶動的外源基因則不表達；

（4）如果向培養(yǎng)基中加入色氨酸， trp啟動子則關閉，沒有cI蛋白合成， PL啟動子帶動的外源基因就可以表達了。

7、敘述一種基因誘變的方法。

重疊延伸誘變:

合成4個引物，包括兩個含有突變堿基的突變引物，這兩個引物反向部分重疊；另兩個引物分別和目的基因的兩端互補（通用引物）；

引物兩兩配對，分兩管進行第一次PCR，產(chǎn)生兩個部分重疊的DNA片段；

將上述兩管PCR產(chǎn)物混合，變性再復性，含有重疊部分的DNA 片段可以配對，然后在DNA聚合酶的作用下延伸產(chǎn)生完整的雙鏈DNA（延伸的4個組合中只有一種可以產(chǎn)生可延伸的3’-OH ）。

除去多余引物，用一對通用引物，以新合成的完整雙鏈DNA為模板進行第二次PCR，可得到含有預期突變位點的DNA片段。

8、簡述重組蛋白藥物生產(chǎn)的主要步驟?

提取蛋白質(zhì)→純化→測氨基酸序列→推導DNA序列→人工合成DNA序列的探針→從文庫中篩選cDNA基因→克隆入表達載體→高效表達→分離純化產(chǎn)物

9、敘述現(xiàn)代發(fā)酵工程流程?

菌種的選育→培養(yǎng)基的配制→滅菌→擴大培養(yǎng)和接種→發(fā)酵過程→分離提純

14、DNA疫苗的優(yōu)越性 

1）DNA比蛋白質(zhì)穩(wěn)定，可以保存較長的時間；

2）DNA的提取和純化也比蛋白質(zhì)容易，適合大規(guī)模生產(chǎn)；

3）DNA片段可以插入質(zhì)粒中制成疫苗，而且在一個質(zhì)粒上可以同時容納多個抗原基因。因此可以一次注射就獲得多種免疫能力；

4）DNA疫苗對于一些目前難以用常規(guī)疫苗防治的疾病的預防和治療有重要意義。

10、簡述限制性內(nèi)切酶PstⅠ的生產(chǎn)流程?

   PBR322       HindⅢ酶解       P.stuartio的核DNA

                   重組

噬菌體    侵染

                   轉(zhuǎn)化大腸桿菌

                          產(chǎn)生抗性

            對噬菌體有裂解作用的轉(zhuǎn)化子            有限制性內(nèi)切酶基因，培養(yǎng)

                PstI內(nèi)切酶活性檢測

               檢測PstI甲基化酶活性

11、如何在串聯(lián)的氣升式反應器中完成T4連接酶的大規(guī)模生產(chǎn)。

把大腸桿菌菌株NM989放在兩個生物反應器中分別生長和進行誘導，細胞懸液從生長階段到誘導階段的流動通過管子相連，由泵控制：

§ 生長階段：30℃，外管氣升式反應器體積為10L，此階段連接酶基因不表達；

§ 誘導階段：42℃，反應器體積為5L，此階段可以特定速率取出細胞用于下游純化。

12、如何改造蘇云金桿菌菌株，使其在營養(yǎng)生長階段表達毒素蛋白？其依據(jù)為何？

    蘇云金桿菌只在孢子形成階段才合成蘇云金桿菌前毒素蛋白。若將該基因在營養(yǎng)生長時期就轉(zhuǎn)錄和翻譯，就可以通過連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)毒素，降低生產(chǎn)成本。

蘇云金桿菌的孢子形成過程中，有一個特定的轉(zhuǎn)錄因子（σ因子），可以與此時期活躍的基因的啟動子相互作用，啟動它們的轉(zhuǎn)錄。

蘇云金桿菌的毒素基因的啟動子就是在這一轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下，只在孢子形成時轉(zhuǎn)錄；如果用一個營養(yǎng)時期活躍的啟動子帶動基因表達，則蘇云金桿菌的毒素基因就可以在營養(yǎng)生長階段表達。

13、如何分離固氮相關基因？

遺傳互補法。從野生型固氮基因文庫中堅定分析能使各種突變體恢復固氮能力的克隆。分別將光譜宿主克隆載體和固氮菌株的總DNA用限制性內(nèi)切酶酶解，將酶解后的兩者連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，篩選構建野生型微生物的基因文庫A，同時用誘變劑處理微生物細胞，篩選出無氮不生長的突變型微生物B，將AB接合，在不含氮的培養(yǎng)基上，篩選、提取生長的菌落的DNA即可得到。

15、如何獲得結瘤作用基因？

遺傳互補法，即用野生型苜蓿中華根瘤菌的基因文庫轉(zhuǎn)化不能結瘤的苜蓿中華根瘤菌突變體（nod-），然后篩選出可形成根瘤的重組根瘤菌：

（1）建立野生型苜蓿中華根瘤菌的基因文庫

（2）基因文庫包裝入λ噬菌體并引入大腸桿菌，經(jīng)結合作用進入苜蓿中華根瘤菌突變株（nod-），載體上的四環(huán)素抗性基因可作為選擇標記

（3）培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的苜蓿中華根瘤菌并檢驗它們在根上形成根瘤的能力

（4）從能形成根瘤的苜蓿植株的根瘤中分離苜蓿中華根瘤菌，找到載體上的插入片段，進行亞克隆和進一步分析

（5）以分離到的結瘤基因為探針，在基因文庫中篩選與其相鄰的DNA片段，來獲得更多基因。

16、如何分離纖維素酶？

原核：1.從原核生物中克隆編碼葡聚糖內(nèi)切酶基因：

（1） 構建能分解纖維素的原核生物的核基因文庫，在含有抗性選擇性平板上培養(yǎng)宿主菌

（2） 菌落在含羧甲基纖維素的平板上37°培養(yǎng)，能夠產(chǎn)生并分泌葡聚糖內(nèi)切酶的菌落周圍的羧甲基纖維素會被部分分解

（3） 水解區(qū)域可通過剛果紅染色觀察，呈紅色

2.分離葡聚糖外切酶基因：采用免疫學方法篩選帶有重組的葡聚糖外切酶基因的克隆

3.分離β-葡糖苷酶基因：構建能產(chǎn)生β-葡糖苷酶的微生物的核基因文庫

17、酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點有哪些？

（1）對其遺傳學和生理學的研究較為深入，已獲得全部基因組序列；

（2）酵母在小量和大規(guī)模的生物反應器中都能快速生長

（3）有幾個很強的酵母基因啟動子，其中酵母細胞內(nèi)2μm質(zhì)粒可作為內(nèi)源表達載體；

（4）可以對蛋白進行多種翻譯后修飾

（5）自然分泌蛋白少，純化較方便

（6）具有較高的安全性（7）與高等真核生物非常相像。

18、獲得轉(zhuǎn)基因哺乳動物細胞的方法有哪些？

（1）借助于載體的基因轉(zhuǎn)移：適用于哺乳動物細胞的載體，直接或與野生型病毒一起轉(zhuǎn)染目的細胞。

（2）顯微注射法：把目的基因用顯微注射的方法直接注入目的細胞的細胞質(zhì)或細胞核。

（3）磷酸鈣介導的DNA導入：DNA與磷酸鈣共沉淀后，DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒中，這種微型磷酸鈣晶體可使目的細胞產(chǎn)生吞噬泡，并使吞噬泡的膜局部溶解，DNA由此進入細胞。

（4）電擊法：將目的細胞與外源DNA共培養(yǎng)，向培養(yǎng)液施加一個瞬時高電壓，使得目的細胞的細胞膜暫時出現(xiàn)孔洞，外源DNA即由此孔洞進入細胞。

（5）脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移：將外源DNA包裹在脂質(zhì)體中，一起轉(zhuǎn)入細胞。

（6）染色體介導的基因轉(zhuǎn)移：用離心分離法或流式細胞儀分離法將染色體分離出來之后，以其為媒介將外源基因?qū)肽康募毎?/font>