?。ㄒ唬┹d玻片

　　載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時需用石英玻璃載玻片。

　　（二）蓋玻片

　　蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標本。

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　　組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。

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　　封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

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　　一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質(zhì)量略有影響。

　?。?）嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。

　?。?）應在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強光穩(wěn)定后，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。

　?。?）防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應戴上防護眼鏡。

　?。?）檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。

　?。?）熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節(jié)　省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數(shù)次點燃光源。

　?。?）標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。

　?。?）熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“一”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確可見的熒光。“++”—可見有明亮的熒光。“+++”—可見耀眼的熒光。

　　熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術科學的發(fā)展，在不同程度上采用客觀指標記錄判斷結(jié)果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。

　　熒光顯微鏡攝影技術對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統(tǒng)裝置。

吖啶橙：吖啶橙是最經(jīng)典的靈敏的熒光染料，它可對細胞中的DNA和RNA同時染色而顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。
EB:染色DNA和RNA
熒光素雙醋酸酯(FDA)：FAD 本身無熒光,無極性,可透過完整的原生質(zhì)膜。 一旦進入原生質(zhì)體后,由于受到酯酶分解而產(chǎn)生 具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。它不能自由出入原 生質(zhì)膜,因此有活力的細胞能產(chǎn)生熒光,無活力 的原生質(zhì)體不能分解FAD無熒光產(chǎn)生。5mgFDA溶于1ml丙酮中,避光4℃下貯存,使用 時取0.22mlFDA貯存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中.使用時,使最終濃度為0.01%。
熒光染料Ho33342和若丹明123: 活細胞雙熒光染色觀察細胞核和線粒體。一般的生物染料不能穿透細胞膜，只有當細胞被固定后改變了細胞膜的通透性，染料才能進入細胞內(nèi)。但有些活體染料能進入活細胞，并對細胞不產(chǎn)生毒性作用。熒光染料Ho33342和若丹明123都是活體染料。Ho33342能與細胞中DNA進行特異的結(jié)合，若丹明123能與線粒體進行特異的結(jié)合。采用兩種熒光染料的混合染液可對一個活細胞的核和線粒體同時染色。

1．每種熒光染料，均有自己的最適PH值，此時熒光最強。當pH改變時，不僅熒光強度減弱，而且波長將有所改變，因此熒光檢測時要在一定的PH值的緩沖液中進行。
2．一放熒光染色在20。C以下時熒光比較穩(wěn)定，溫度升高常出現(xiàn)溫度猝滅。
3．在熒光觀察中，常因激發(fā)光的增強而使樣品熒光很快衰竭，造成觀察和照相困難。為此最好用能量小的長波長光進行觀察，需照相時再適當增強激發(fā)光。
4．一般熒光染液的濃度在萬分之一以下，甚至億萬分之一，也能使標本著色。在一定的限度內(nèi)，熒光強度可隨熒光素的濃度增加而增強，但超過限度，熒光強度反而下降，這是由于熒光分子間的締合而使自身熒光猝滅所致。

使用方法：
(1)將材料片放在載物臺上。
(2)開啟熒光顯微鏡穩(wěn)壓器．然后按下啟動組點燃紫外燈15min內(nèi)不得關閉，關閉后3min內(nèi)不得再啟動。
(3)將激發(fā)濾光片轉(zhuǎn)至v，分色片調(diào)到v，選用495或475nm阻擋濾光片。
(4)選用uvFL40、uvFL100熒光接物鏡鏡檢。
(5)在玻片上加無熒光油，先用40 x，再用100 x調(diào)焦鏡檢．呈現(xiàn)熒光。
(7)因熒光物質(zhì)受紫外光照射時隨時間的增長熒光逐漸變?nèi)?，因此鏡檢時應經(jīng)常變換視野。
(8)亦可用uvFL10或uvFL20低倍鏡鏡檢材料(用低倍鏡時不加無熒光油)。

1. 開機：
1.1. 打開房間總電源開關
1.2. 打開電腦電源開關
1.3. 打開數(shù)碼相機電源開關
1.4. 打開顯微鏡電源開關（打開汞燈電源開關）

2. 調(diào)試顯微鏡光路：
2.1. 把載玻片放到載物臺上。調(diào)節(jié)聚焦。
2.2. 根據(jù)物鏡指數(shù)乘0.8確定聚光鏡光圈值，調(diào)整到位。
2.3. 將視場光闌縮小，然后調(diào)節(jié)聚光鏡高度，直到從目鏡中觀察到視場光闌的清晰成像。
2.4. 放大視場光闌，使其在目鏡中的黑框擴展到視野以外。

3. 調(diào)試數(shù)碼相機拍攝照片：
3.1. 在顯微鏡取景器中對好視野及焦距。
3.2. 打開photoshop程序。
3.3. 點擊 “文件 -- 自動…。”調(diào)出相機控制窗口。
3.4. ZOOM定為77。拍攝圖片格式為640*480。
3.5. 在相機控制窗口上點preview，觀察預覽圖象的亮度。選擇適當?shù)钠毓鈺r間使預覽圖片的亮度合適。
3.6. 點拍攝按紐拍攝，等待幾秒鐘后圖片傳回電腦并在photoshop窗口里顯示。
3.7. 繼續(xù)拍攝下一張照片。
3.8. 拍攝十來張照片后要及時保存照片。
3.9. 先關閉相機控制按紐。并保存拍攝條件到默認值。
3.10. 在photoshop中保存剛拍攝的照片到指定文件夾中，保存后要關閉照片。
3.11. 保存并關閉全部照片后重新打開相機控制窗口繼續(xù)拍攝。
3.12. 拍攝全部完成后保存所拍攝的照片。需要時將照片通過網(wǎng)絡上傳到校園網(wǎng)服務器上，不能使用U盤或軟盤轉(zhuǎn)移文件?；蛘邔⒄掌募啼浀焦獗P上。

4. 關機：
4.1. 關閉顯微鏡電源。
4.2. 關閉汞燈電源。
4.3. 關閉數(shù)碼相機電源。
4.4. 關閉電腦時點“重新啟動電腦”，待電腦進入關閉狀態(tài)并重新啟動時按電腦電源開關強制關機。注意不能直接點擊“關閉電腦”。
4.5. 關閉房間電源總開關。

1、 初次使用者事先要經(jīng)過培訓。
2、 該顯微鏡有2套拍照系統(tǒng)；傳統(tǒng)膠卷拍照和數(shù)碼拍照。根據(jù)需要可更換相應的附件。
3、 該鏡可作為明視場顯微鏡使用，也可作為熒光顯微鏡使用，根據(jù)需要，做相應的附件連接，開啟相應的電源。禁止亂調(diào)設置，以免影響他人正常使用。
4、 作為明視場顯微鏡使用；A、接通電源后，打開顯微鏡底座前的電源開關，按光亮需要調(diào)節(jié)底座右側(cè)的滑竿。B、根據(jù)需要，調(diào)節(jié)底座光柵和聚光器光柵及其高度，可獲得最佳的圖象效果。C、需要圖片，要把鏡體上的相應拉桿拉到綠線位子。按下相應附件上的照相按扭。
5、 作為熒光顯微鏡使用；A、先關閉熒光通道，再打開熒光激發(fā)器電源，等待15分鐘。B、等待期間，打開顯微鏡光源，找到需要觀察的樣品，選用合適的物鏡，調(diào)整焦距。C、關閉顯微鏡光源，打開熒光通道。D、需要圖片，要把鏡體上的相應拉桿拉到綠線位子。按下相應附件上的照相按扭。

注意事項：
1、 不要污染物鏡鏡頭。一旦污染，先用擦鏡紙擦除一遍，再用顯微鏡專用擦洗液擦洗，最后用鏡紙再擦一遍。用油鏡鏡頭后，以同樣方法擦洗。
2、 關閉顯微鏡電源前，先把光源調(diào)到最低。
3、 用過熒光鏡的，注意清潔載物臺，防止有害有毒致癌物污染。
4、 結(jié)束工作，關閉所有電源，清潔工作臺和房間。
5、 發(fā)現(xiàn)漏電和其他故障，及時報告。