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第四章 微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)基 營養(yǎng)或營養(yǎng)作用(nutrition)：生物體從外部環(huán)境吸收生命活動(dòng)所必需的物質(zhì)和能量，以滿足其生長和繁殖需要的一種生理功能。 參與營養(yǎng)過程并具有營養(yǎng)功能的物質(zhì)稱為營養(yǎng)物(nutrient)。 第一節(jié) 微生物的營養(yǎng)要素 一 碳源 (carbon source) 總體上，微生物能利用的碳源的種類及形式極其廣泛多樣（參P83表），但不同微生物對(duì)碳源的利用因種不同而差異懸殊； 對(duì)于利用有機(jī)碳源的異養(yǎng)型微生物來說，其碳源往往同時(shí)又是能源。此時(shí)，可認(rèn)為碳源是一種具有雙功能的營養(yǎng)物。還有一些種類較少的自養(yǎng)型微生物，則以CO2為主要碳源； 工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中所供給的碳源，大多數(shù)來自植物體，如山芋粉、玉米粉、麩皮、米糠、糖蜜等，其成分以碳源為主，但也包含其他營養(yǎng)成分。實(shí)驗(yàn)室中，常用于微生物培養(yǎng)基的碳源主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、甘油和有機(jī)酸等。 二 氮源 (nitrogen source) 工業(yè)發(fā)酵中利用的有機(jī)含氮化合物，主要來源于動(dòng)物、植物及微生物體，例如魚粉、黃豆餅粉、酵母提取物、發(fā)酵廢液及廢物中的菌體等。銨鹽、硝酸鹽、蛋白胨和肉湯等則是實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物常用的氮源。 三 能源 (energy source) 能作為化能自養(yǎng)微生物的能源都是一些還原態(tài)無機(jī)物，如NH4+、NO2–、S、H2S、H2和Fe2+等。能氧化利用這些物質(zhì)獲得能量的微生物都是細(xì)菌，如亞硝酸細(xì)菌、硝酸細(xì)菌、硫化細(xì)菌、硫細(xì)菌、氫細(xì)菌和鐵細(xì)菌等。由于化能自養(yǎng)微生物的存在，說明生物界的能源并非都是直接或間接的依靠太陽能。 四 生長因子（growth factor） 某些微生物生長所必需、其自身又不能合成或合成量不足以滿足自身生長，需要外源提供的微量有機(jī)物。狹義的生長因子一般僅指維生素；廣義的生長因子除維生素外，還包括氨基酸、堿基、脂肪酸等。 根據(jù)各種微生物與生長因子的關(guān)系可分以下幾類（了解）：生長因子自養(yǎng)型微生物、生長因子異養(yǎng)型微生物、生長因子過量合成型微生物、生長因子缺陷型微生物。 通常由于對(duì)某些微生物所需的生長因子不了解，因此常在培養(yǎng)這些微生物的培養(yǎng)基里加入酵母膏、牛肉膏、玉米漿、肝浸液、麥芽汁或其他新鮮的動(dòng)植物組織浸出液等物質(zhì)以滿足它們對(duì)生長因子的需要。 五 無機(jī)鹽（inorganic salt，mineral salt） 無機(jī)鹽或礦質(zhì)元素主要為微生物提供除C、N源以外的各種生物元素。 凡生長所需濃度在10-3～10-4mol/L范圍內(nèi)的元素，稱為大量元素，如P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe等；凡生長所需濃度在10-6～10-8mol/L范圍內(nèi)的元素，則稱微量元素，如Mn、Zn 、Cu、Cl、Co、Mo、Ni、B、W、 Sn、Se等。不同微生物有時(shí)所需的無機(jī)鹽濃度有時(shí)差別很大，上述劃分只是使用上的方便?！?/font> 無機(jī)鹽的生理功能（參P86表，了解） 在配制微生物培養(yǎng)基時(shí)，對(duì)于大量元素，可加入相關(guān)化學(xué)試劑，常用 K2HPO4 及 MgSO4 ，它們可提供 4 種需要量最大的元素。對(duì)于微量元素，由于水、化學(xué)試劑、玻璃器皿或其他天然成分的雜質(zhì)中已含有可滿足微生物生長需要的各種微量元素，因此在配制普通培養(yǎng)基時(shí)一般不再另行添加。但如果要配制研究營養(yǎng)代謝等的精細(xì)培養(yǎng)基，所用的玻璃器皿應(yīng)是硬質(zhì)的，試劑是高純度的，此時(shí)就須根據(jù)需要加入必要的微量元素。 六 微生物對(duì)水分的吸收或排出決定于水的活度。水活度用aw (activity of water)表示，即一定溫度和壓力下，溶液的蒸汽壓 ( p )和純水蒸汽壓( po ) 之比：aw = p／p o（參P93-94) 微生物生長所要求的aw值，一般在0.60~0.99之間，每一種微生物的生長都有一適應(yīng)范圍及最適的aw值，且這個(gè)aw值是相對(duì)恒定的。如果微生物生長環(huán)境的aw值大于菌體生長的最適aw值，細(xì)胞就會(huì)吸水膨脹，甚至引起細(xì)胞破裂。 反之，如果環(huán)境aw值小于菌體生長的最適aw值，則細(xì)胞內(nèi)的水分就會(huì)外滲，造成質(zhì)壁分離，使細(xì)胞代謝活動(dòng)受到抑制甚至引起死亡。為了抑制有害微生物生長，往往加入高濃度食鹽或蔗糖，降低環(huán)境中的aw值，使菌體不能正常生長，從而達(dá)到長久保存食品的目的。 第二節(jié) 根據(jù)微生物生長所需要碳源的性質(zhì)，可將微生物分成自養(yǎng)型（autotroph）與異養(yǎng)型（heterotroph）兩大類；又可根據(jù)微生物生長所需能量來源不同可分成化能營養(yǎng)型(chemotroph)與光能營養(yǎng)型 (phototroph)；還可根據(jù)其生長時(shí)能量代謝過程中氫供體性質(zhì)的不同來分，將微生物分成有機(jī)營養(yǎng)型（organotroph）與無機(jī)營養(yǎng)型(lithotroph)。 綜合起來，可將微生物營養(yǎng)類型劃分為四種基本類型，即化能有機(jī)營養(yǎng)型（化能異養(yǎng)型）、化能無機(jī)營養(yǎng)型（化能自養(yǎng)型）、光能有機(jī)營養(yǎng)型（光能異養(yǎng)型）與光能無機(jī)營養(yǎng)型（光能自養(yǎng)型）。(參P87表) 第三 節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的方式 微生物沒有專門的攝食器官，各種營養(yǎng)物質(zhì)直接通過細(xì)胞膜的滲透和選擇性吸收進(jìn)入細(xì)胞。營養(yǎng)物質(zhì)從微生物所處的周圍環(huán)境通過細(xì)胞膜進(jìn)人細(xì)胞的方式，可分為四種類型，即簡單擴(kuò)散、促進(jìn)擴(kuò)散、主動(dòng)運(yùn)輸和基團(tuán)轉(zhuǎn)位。(參考P89表和P90圖)。 1.簡單擴(kuò)散 是一種最為簡單的營養(yǎng)物質(zhì)吸收進(jìn)入細(xì)胞的方式。在簡單擴(kuò)散中，營養(yǎng)物質(zhì)在擴(kuò)散通過細(xì)胞膜的過程中不消耗能量，也不發(fā)生化學(xué)變化。物質(zhì)擴(kuò)散的動(dòng)力是物質(zhì)在膜內(nèi)外的濃度差；通過細(xì)胞膜中的含水小孔由高濃度的胞外環(huán)境向低濃度的胞內(nèi)擴(kuò)散，這種擴(kuò)散是非特異性的；但膜上小孔的大小和形狀對(duì)被滲透擴(kuò)散的營養(yǎng)物質(zhì)的分子大小有一定的選擇性。 簡單擴(kuò)散不是微生物吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要方式，以這種方式運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)主要是一些分子量小與脂溶性的物質(zhì)。如水、一些氣體（如氧）、甘油和某些離子，如大腸桿菌以簡單擴(kuò)散方式吸收鈉離子等。 2.促進(jìn)擴(kuò)散 營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)促進(jìn)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的運(yùn)輸過程中，需要借助位于膜上的一種載體蛋白的參與，并且每種載體蛋白只運(yùn)輸相應(yīng)的物質(zhì)。因此，促進(jìn)擴(kuò)散對(duì)被運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)具有高度專一性，被傳送的物質(zhì)先在細(xì)胞膜外面與載體蛋白結(jié)合，然后在細(xì)胞內(nèi)表面釋放。載體蛋白能促進(jìn)物質(zhì)運(yùn)輸加快進(jìn)行，但營養(yǎng)物質(zhì)仍不能逆濃度梯度吸收。促進(jìn)擴(kuò)散的運(yùn)輸方式多見于真核微生物，例如酵母菌，某些物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌是通過這種方式完成的。 3.主動(dòng)運(yùn)輸 需消耗能量，且可逆濃度梯度運(yùn)輸，是一種廣泛存在于微生物中的主要物質(zhì)運(yùn)輸方式。與上述促進(jìn)擴(kuò)散方式不同，在主動(dòng)運(yùn)輸中，載體分子構(gòu)型變化以消耗能量為前提。微生物在生長與繁殖過程中所需要的多數(shù)營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸等主要是通過此方式運(yùn)輸?shù)摹?/font> 4.基團(tuán)移位 一種既需要載體蛋白又需要消耗能量的物質(zhì)運(yùn)輸方式。與主動(dòng)運(yùn)輸方式不同的是它有一個(gè)復(fù)雜的運(yùn)輸酶系統(tǒng)來完成物質(zhì)的運(yùn)輸，同時(shí)底物在運(yùn)輸過程中發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)變化。這種運(yùn)輸方式主要存在于厭氧細(xì)菌和兼性厭氧細(xì)菌中，主要用于糖的運(yùn)輸以及脂肪酸、核苷、堿基等物質(zhì)的運(yùn)輸。 第四節(jié)
培養(yǎng)基（medium）是人工配制，適合微生物生長繁殖和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物用的混合養(yǎng)料。
自學(xué)內(nèi)容要求： 掌握：選用和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的4個(gè)原則和4種方法；碳氮比、水活度的概念；不同滲透條件對(duì)微生物細(xì)胞的影響；培養(yǎng)基pH內(nèi)源調(diào)節(jié)的方法。 了解：各大類微生物（從整體看）最適生長的pH范圍、生長最低aw值；微生物對(duì)氧化還原電勢(shì)的要求。 二培養(yǎng)基的種類 掌握：培養(yǎng)基的分類方法；各種培養(yǎng)基的性質(zhì)、優(yōu)缺點(diǎn)及其應(yīng)用；選擇性培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)原理和方法；EMB培養(yǎng)基的原理。 了解：瓊脂作為凝固劑的優(yōu)點(diǎn) 一 培養(yǎng)基配制應(yīng)遵循的原則 ① 根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基； ② 控制好不同營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例，保持合適的pH、氧化還原電勢(shì)、滲透壓或aw； 在實(shí)踐中，針對(duì)某些微生物在生長過程中產(chǎn)酸性或堿性代謝產(chǎn)物較多的情況，在配制培養(yǎng)基時(shí)常添加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽，以維持培養(yǎng)基pH的相對(duì)穩(wěn)定；常用的緩沖劑是K2HPO4與KH2PO4組成的混合物或CaCO3。 ③ ④ 經(jīng)濟(jì)節(jié)約(生產(chǎn)上)。在所選培養(yǎng)基成分能滿足微生物培養(yǎng)要求的前提下，一般盡可能選用價(jià)格低廉，資源豐富的材料作培養(yǎng)基成分。 二 培養(yǎng)基的類型 培養(yǎng)基種類很多，可根據(jù)構(gòu)成培養(yǎng)基的成分、物理狀態(tài)、用途將培養(yǎng)基分成若干類型。 1. 合成、半合成與天然培養(yǎng)基 根據(jù)構(gòu)成培養(yǎng)基的化學(xué)成分的了解程度，可將培養(yǎng)基分成合成、半合成和天然培養(yǎng)基三大類。 （1）天然培養(yǎng)基(complex media, undefined media) 指用化學(xué)成分并不十分清楚或化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物質(zhì)配制而成培養(yǎng)基。常用的有機(jī)物有牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、麥芽汁、豆芽汁、玉米粉、麩皮、牛奶、血清等。如實(shí)驗(yàn)室常用于培養(yǎng)細(xì)菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等就屬于此類培養(yǎng)基。 優(yōu)點(diǎn)是營養(yǎng)豐富、種類多樣、配制方便、價(jià)格低廉；缺點(diǎn)是成份不十分清楚、不穩(wěn)定。因此，通常只適用于一般實(shí)驗(yàn)室中的菌種培養(yǎng)、發(fā)酵工業(yè)中生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)和某些發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)等。 （2）合成培養(yǎng)基（synthetic media） 又稱組合培養(yǎng)基。它是由化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基。例如用于分離培養(yǎng)放線菌的高氏1號(hào)培養(yǎng)基，其組成分均為明確已知的化學(xué)成分。 優(yōu)點(diǎn)是成份精確、重演性高；缺點(diǎn)是價(jià)格較貴、配制麻煩，且微生物生長較一般，因此，通常僅適用于營養(yǎng)、代謝、生理、生化、遺傳、育種、菌種鑒定或生物測(cè)定等對(duì)定量要求較高的研究工作中。 （3）半合成培養(yǎng)基（semi-synthetic media） 又稱半組合培養(yǎng)基。是指一類主要用已知化學(xué)成分的試劑配制，同時(shí)又添加某些未知成分的天然物質(zhì)制備而成的培養(yǎng)基。如一般用于培養(yǎng)霉菌的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。 2. 液體、固體與半固體培養(yǎng)基 根據(jù)其物理狀態(tài)將培養(yǎng)基分成液體、固體培養(yǎng)基與半固體培養(yǎng)基等類型。 （1）液體培養(yǎng)基（liquid media） 指呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。無論在實(shí)驗(yàn)室還是生產(chǎn)實(shí)踐中，液體培養(yǎng)基被廣泛應(yīng)用。尤其是工業(yè)生產(chǎn)上，液體培養(yǎng)基被用于培養(yǎng)微生物細(xì)胞或獲得代謝產(chǎn)物。 （2）固體培養(yǎng)基（solid media） 即指呈固化狀態(tài)的培養(yǎng)基。根據(jù)固態(tài)性狀，又可分為以下幾種類型： ① 固化培養(yǎng)基也稱固體培養(yǎng)基，是由液體培養(yǎng)基中加入凝固劑而成。瓊脂（agar）（融化溫度、凝固溫度分別約為96℃和 40℃）是最優(yōu)良且應(yīng)用最廣泛的凝固劑。常在液體培養(yǎng)基中加入1％~2%的瓊脂配制固體培養(yǎng)基。 ② 不可逆固體培養(yǎng)基這類培養(yǎng)基一旦凝固就不能再被融化，故稱之為不可逆固體培養(yǎng)基。如醫(yī)學(xué)微生物分離培養(yǎng)中常用的血清培養(yǎng)基及用于化能自養(yǎng)細(xì)菌的分離、純化與培養(yǎng)的硅膠培養(yǎng)基等。 ③ 天然固體培養(yǎng)基指由天然固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)制備而成的固體培養(yǎng)基。常用的天然固態(tài)營養(yǎng)基質(zhì)有麥麩、米糠、木屑、植物桔桿纖維粉、馬鈴薯片、胡蘿卜條、大豆、大米、麥粒等。如食用菌生產(chǎn)常用植物秸桿纖維粉為主要原料的天然固體培養(yǎng)基。 ④ 濾膜 固體培養(yǎng)基在科研和生產(chǎn)實(shí)踐上用途廣泛，如菌種分離、鑒定、菌落計(jì)數(shù)、檢驗(yàn)雜菌、選種、育種、菌種保藏、生物活性物質(zhì)的生物測(cè)定，獲取大量真菌孢子，以及用于微生物的固體培養(yǎng)和大規(guī)模生產(chǎn)等。 （3）半固體培養(yǎng)基(semi-solid media) 在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑而制成的堅(jiān)硬度較低的固體培養(yǎng)基。一般常用的瓊脂濃度為0.2％ ~0.7%。半固體培養(yǎng)基常用于細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀察、趨化性研究、厭氧菌培養(yǎng)、分離和計(jì)數(shù)，細(xì)菌和酵母菌的菌種保藏，以及雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)等。 3. 選擇與鑒別培養(yǎng)基 根據(jù)培養(yǎng)基對(duì)微生物的功能可分為選擇性培養(yǎng)基和鑒別性培養(yǎng)基等。 （1）選擇性培養(yǎng)基（selective media） 根據(jù)某些微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對(duì)化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，具有使混合菌中的劣勢(shì)菌變成優(yōu)勢(shì)菌的功能，廣泛用于菌種篩選等領(lǐng)域。 選擇性培養(yǎng)基配制時(shí)可根據(jù)不同的用途選擇特殊的營養(yǎng)成分或添加特定的抑制劑，以達(dá)到分離特定微生物的目的。在實(shí)踐中有兩種方式，一種是正選擇（投其所好），另一種是反選擇（取其所抗）。 正選擇是添加某種特定成分為培養(yǎng)基主要或唯一的營養(yǎng)物，以分離能利用該種營養(yǎng)物的微生物。如從混雜的微生物群落中選擇性地分離能利用纖維素的微生物時(shí)，則把纖維素作為選擇培養(yǎng)基的唯一碳源，把混雜的微生物群落樣品涂布于此種培養(yǎng)基上，凡能在該培養(yǎng)基上生長繁殖的微生物即為能利用纖維素的微生物。以此類推，可以分離利用各種各樣營養(yǎng)物的微生物。 反選擇是在培養(yǎng)基中加入某種或某些微生物生長抑制劑，以抑制所不希望出現(xiàn)的微生物，從而從混雜的微生物群體中分離不被抑制和所需要的目標(biāo)微生物。如在選擇培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素以抑制細(xì)菌，從而分離霉菌與酵母菌；在基因工程中，也常用加入抗生素的選擇培養(yǎng)基來篩選帶有抗生素標(biāo)記基因的基因工程菌株或轉(zhuǎn)化子。 （2）鑒別性培養(yǎng)基（differential media） 用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基。如在培養(yǎng)基成分中加有能與目的菌的無色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而達(dá)到只須用肉眼辨別顏色就能方便地從近似菌落中找出目的菌菌落的培養(yǎng)基。 鑒別培養(yǎng)基主要用于微生物的分類鑒定和分離或篩選產(chǎn)生某種或某些代謝產(chǎn)物的微生物菌株。 如伊紅美藍(lán)（Eosin Methylene Blue，EMB）培養(yǎng)基中的伊紅和美藍(lán)兩種苯胺染料可抑制G＋菌和一些難培養(yǎng)G－菌。在低酸度下，這兩種染料會(huì)結(jié)合并形成沉淀，起著產(chǎn)酸指示劑的作用。因此，試樣中多種腸道細(xì)菌會(huì)在EMB培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生易于用肉眼識(shí)別的多種特征性菌落，特別是E.coli因其能強(qiáng)烈分解乳糖而產(chǎn)生大量混合酸，表面帶H＋，故可染上酸性染料伊紅，伊紅與美藍(lán)結(jié)合使菌落呈現(xiàn)深紫色，且從菌落表面的反射光中還可看到似金龜子色的綠色金屬閃光。 關(guān)于選擇性、鑒別性培養(yǎng)基只是為應(yīng)用方便而人為劃分的。實(shí)際應(yīng)用時(shí)兩種功能常結(jié)合在一起，如EMB培養(yǎng)基既是鑒別性培養(yǎng)基又是選擇性培養(yǎng)基。 本章思考題 1.名詞解釋：異養(yǎng)菌、自養(yǎng)菌、生長因子、生長限制因子、碳氮比、培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基、組合培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基、鑒別性培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基。 2.試述微生物營養(yǎng)中的6大要素物質(zhì)及其生理功能。 3.什么是碳源？什么是氮源？工業(yè)發(fā)酵和實(shí)驗(yàn)室常用的微生物碳源和氮源物質(zhì)分別有哪些？ 4.何謂培養(yǎng)基？根據(jù)對(duì)培養(yǎng)基成分的了解程度、外觀物理狀態(tài)和對(duì)微生物的功能分別可分為哪幾種類型？其特點(diǎn)和用途徑分別如何？ 5.比較微生物吸收營養(yǎng)物質(zhì)四種方式的異同點(diǎn)。 6.試舉細(xì)菌、放線菌和真菌培養(yǎng)基各一種，并指出每一種培養(yǎng)基中各組分的功能。 7.如果要從自然界中分離特定類型的微生物(如降解某種農(nóng)藥的細(xì)菌、耐酒精的酵母菌)，你如何根據(jù)所學(xué)知識(shí)去選用或配制適合的培養(yǎng)基？ |
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